摘要: 探讨七氟烷对体外循环(CPB)所致脑损伤大鼠未折叠蛋白反应(UPR)相关性细胞凋亡的影响。方法将48只SD大鼠按随机数字表法分为3组:假手术组、CPB组和七氟烷组,每组16只。假手术组仅行动脉和静脉穿刺置管;CPB组建立CPB模型后流量逐步调至最大[100 mL/(kg·min)]并维持转流60 min;七氟烷组先予2%七氟烷吸入30 min,休息15 min后处理同CPB组。取各组大鼠皮层和海马组织,测定脑组织湿/干重比,伊文思蓝(EB)法检测血脑屏障通透性,光镜下观察海马组织形态学改变,电镜下观察海马组织超微结构改变,TUNEL法检测海马细胞凋亡情况并计算细胞凋亡指数,RT-PCR检测海马组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)同源蛋白(CHOP)、c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)mRNA的表达,Western blotting检测海马组织中GRP78、CHOP、磷酸化JNK(p-JNK)和Caspase-12蛋白的表达。结果与假手术组比较,CPB组脑组织湿/干重比、EB含量和海马细胞凋亡指数均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与CPB组比较,七氟烷组脑组织湿/干重比、EB含量和海马细胞凋亡指数均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较,CPB组海马组织形态学及超微结构均发生明显损伤。与CPB组比较,七氟烷组海马组织形态学及超微结构损伤均明显减轻。与假手术组比较,CPB组海马组织中GRP78、CHOP、JNK/p-JNK、Caspase-12mRNA及蛋白表达均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与CPB组比较,七氟烷组海马组织中GRP78、CHOP、JNK/p-JNK、Caspase-12 mRNA及蛋白表达均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论七氟烷对CPB所致脑损伤大鼠具有较好的脑保护作用,其机制可能与七氟烷抑制UPR相关性细胞凋亡有关。

摘要: 探讨长链非编码RNA（Lnc RNA）SNHG1对帕金森病细胞模型SH-SY5Y细胞自噬及生长的影响并初步分析其作用机制。方法 （1）体外培养SH-SY5Y细胞,采用不同浓度1-甲基-4-苯基-吡啶离子（MPP+）作用不同时间后利用Western blotting检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62的表达;四唑盐（MTT）法检测SH-SY5Y的存活率。（2）用不同浓度MPP+作用SH-SY5Y不同时间后利用实时荧光定量PCR技术检测SNHG1的表达。（3）利用特异性siRNA下调SHSY5Y内源性SNHG1的表达,经MPP+处理后Western Blotting检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62的表达,MTT法检测SH-SY5Y的生存率,同时结合自噬晚期抑制剂巴弗洛霉素A1（Baf A1）以及自噬诱导剂雷帕霉素进一步明确SNHG1的作用途径。（4）用不同浓度MPP+作用SH-SY5Y不同时间后采用采用Western blotting实验检测p27的表达,同时特异性下调SHSY5Y内源性SNHG1的表达,经MPP+处理后Western blotting实验检测p27的表达。结果 （1）MPP+作用于SH-SY5Y后LC3-Ⅱ表达明显升高,呈剂量及时间依赖性;同时自噬底物p62表达下降;提示细胞自噬水平升高。MTT结果显示2.50 mmol/L MPP+干预时可明显降低SH-SY5Y的存活率,与其他浓度比较差异有统计学意义（P<0.05）。（2）与阴性对照组比较,MPP+作用SH-SY5Y细胞后SNHG1表达明显升高,呈剂量及时间依赖性。（3）特异性下调SNHG1表达后MPP+诱导的LC3-Ⅱ表达受抑制,同时p62表达升高;而下调SNHG1的同时联合BafA1处理SH-SY5Y可促进LC3-Ⅱ的表达;提示SNHG1主要影响SH-SY5Y的自噬小体形成阶段。MTT结果显示特异性下调SNHG1表达后SH-SY5Y细胞的存活率明显升高,而联合自噬诱导剂雷帕霉素同时处理SH-SY5Y则可进一步抑制其细胞活性;提示SNHG1通过促进SH-SY5Y细胞自噬形成继而抑制其生长。（4）信号通路研究提示,p27在MPP+处理的SH-SY5Y细胞中表达明显升高,呈剂量及时间依赖性;而特异性下调SNHG1表达可抑制p27的表达;提示SNHG1可能通过p27信号通路介导SH-SY5Y细胞的自噬及生长调控。结论长链非编码RNA SNHG1可诱导SH-SY5Y细胞自噬的发生,促进细胞的死亡,其机制可能与p27的表达调控有关。

摘要: 探讨多巴胺受体阻断剂SCH23390对帕金森病(PD)大鼠行为学的影响及对大鼠脚内核(EP)神经元单细胞放电的作用。方法选取成年Wistar大鼠23只颅内注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)制作PD大鼠模型,归为实验组/模型组。另取Wistar大鼠19只注射等量生理盐水为对照组。分别向2组大鼠腹腔注射不同浓度(0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 mg/kg)的SCH23390,进行后续实验。(1)将跑步机转速控制在8r/min,比较药物干预前10min、药物干预后5～15 min、20～30 min、30～40 min、40～50 min以及68～78 min 6个时间段2组大鼠的步频。确定最佳干预剂量及时间后,测定2组大鼠步频及不连续运动频率。(2)将电极植入大鼠EP核团内,使用Plexon多通道信号系统采集2组大鼠注射SCH23390前后清醒静止和连续运动2种状态下的动作电位,使用NeuroExplorer软件分析EP神经元的放电率和变异系数。(3)对2组大鼠进行灌流取脑,冰冻切片,行尼氏染色及组织学鉴定。结果 (1)行为学量化测评确定大鼠腹腔注射SCH23390的最佳浓度和时间分别为0.020 mg/kg,20～30 min和40～50 min。实验组大鼠步频为(24.47±1.35)步/min,对照组大鼠步频为(30.77±2.06)步/min,实验组大鼠较对照组大鼠步频明显降低,差异有统计学意义(t=7.392,P=0.000)。实验组大鼠不连续运动频率为(3.68±0.19)次/min,对照组大鼠不连续运动频率为(2.43±0.18)次/min,实验组大鼠较对照组大鼠明显升高,差异有统计学意义(t=13.351,P=0.000)。(2)SCH23390干预后运动、静止状态下,模型组大鼠EP放电率、变异系数均较干预前明显升高,差异均有统计学意义(P=0.05)。(3)尼氏染色结果显示,模型组大鼠中脑黑质神经元数量少,排列稀疏,着色较浅。组织学位点鉴定结果提示,本实验共采集到EP位点正确的大鼠14只。结论多巴胺D1受体阻断剂对PD大鼠的行为有负调控作用,而且这种调控作用可能是通过改变大鼠EP的电生理活动实现的。

摘要: 探讨小胶质细胞与神经干细胞(NSCs)共同培养条件下对NSCs向多巴胺能神经元分化的促进作用。方法 (1)原代培养新生SD大鼠的小胶质细胞并鉴定。原代培养孕14 d SD大鼠胚胎NSCs并鉴定。(2)取鉴定后细胞分为NSCs单独培养组和小胶质细胞与NSCs共同培养组。2组细胞培养6 d后,采用细胞免疫荧光法及Western blotting实验检测多巴胺能神经元分化与成熟相关因子酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运体(DAT)及炎症因子3(Pitx3)蛋白的表达,采用PCR技术检测2组细胞TH、DAT以Pitx3基因转录水平的差异。结果 (1)新生SD大鼠小胶质细胞CD11b/c染色阳性,所得到的小胶质细胞纯度>95%。孕14dSD大鼠NSCs巢蛋白染色阳性。(2)细胞免疫荧光染色结果显示:与单独培养组比较,共同培养组NSCs TH、DAT及Pitx3阳性蛋白明显增多。Western blotting实验结果显示:共同培养组细胞TH、DAT以及Pitx3蛋白的表达量明显高于单独培养组,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)PCR实验结果显示:共同培养组TH、DAT以及Pitx3基因转录水平均明显高于单独培养组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论小胶质细胞与NSCs共同培养可促进NSCs向多巴胺能神经元分化。

摘要: 观察R-脊椎蛋白3(Rspo3)对小鼠神经干细胞(NSCs)增殖的影响及其机制。方法分离、悬浮培养孕14～15 d的CD1胎鼠大脑侧脑室下区(SVZ)NSCs并通过免疫荧光法鉴定。取第3代处于对数生长期的NSCs分为实验组和对照组,体积各为1mL。实验组添加储存浓度为50μg/mL的Rspo3蛋白0.8μL(终浓度40ng/mL),对照组添加等体积的NSCs培养液。干预后6h通过BrdU细胞渗入实验法检测2组NSCs增殖情况。干预后4 h和8 h采用Western blotting实验检测β-catenin蛋白的表达。结果免疫荧光染色结果显示90%以上细胞呈巢蛋白和SOX2阳性。经过诱导分化后,部分细胞呈神经元核抗原或胶质纤维酸性蛋白阳性,证明实验中提取分离的细胞为NSCs。BrdU细胞渗入实验法显示实验组细胞增殖率为1.56±0.03,明显高于对照组(1.04±0.04),差异有统计学意义(P<0.05)。Western blotting实验显示4 h和8 h时实验组β-catenin蛋白相对表达量分别为1.09±0.10、1.20±0.13,对照组分别为0.56±0.05、0.83±0.04,实验组明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Rspo3蛋白可在体外促进小鼠NSCs增殖,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。

摘要: 探讨炎症性疼痛大鼠中脑导水管周围灰质腹外侧区（vlPAG）P2X7受体激活是否介入曲马多对炎症性疼痛的镇痛作用。方法 112只SD大鼠采用随机数字法分为7组:正常对照组、生理盐水组、福尔马林组、福尔马林+低剂量曲马多组、福尔马林+中剂量曲马多组、福尔马林+高剂量曲马多组和福尔马林+高剂量曲马多+A-438079组,每组16只。对福尔马林组、福尔马林+低剂量曲马多组、福尔马林+中剂量曲马多组、福尔马林+高剂量曲马多组大鼠足底注射5%福尔马林100μL以建立炎症性疼痛模型,福尔马林+低剂量曲马多组、福尔马林+中剂量曲马多组、福尔马林+高剂量曲马多组大鼠建模成功后分别鞘内注射曲马多5、15、25μg/kg（溶于20μL生理盐水中）,福尔马林组鞘内注射0.9%生理盐水20μL;福尔马林+高剂量曲马多+A-438079组大鼠于vlPAG注射P2X7受体特异性拮抗剂A-438079（100pmol/0.3μL）后足底注射5%福尔马林100μL以建立炎症性疼痛模型,再给予鞘内注射25μg/kg曲马多（溶于20μL生理盐水中）。于福尔马林注射后5、10、15、25、35、40、50、60 min时间点观察各组大鼠炎症性疼痛行为并进行疼痛评分,观察终点时采用免疫组化染色和Western blotting检测前6组大鼠vlPAG中P2X7受体阳性细胞数和蛋白表达水平。结果 （1）福尔马林组大鼠在各观察时间点的疼痛评分及vlPAG中P2X7受体阳性细胞数、蛋白表达水平均明显升高,与正常对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）福尔马林+中剂量曲马多组自福尔马林注射后25min起,福尔马林+高剂量曲马多组自福尔马林注射后15 min起各观察时间点的疼痛评分较福尔马林组均明显降低,vlPAG中P2X,受体阳性细胞数、蛋白表达水平较福尔马林组均明显升高,差异均有统计学意义（P<0.05）。（3）福尔马林+高剂量曲马多组自福尔马林注射后15 min起各观察时间点的疼痛评分较福尔马林+中剂量曲马多组均明显降低,vlPAG中P2X7受体阳性细胞数、蛋白表达水平较福尔马林+中剂量曲马多组均明显升高,差异均有统计学意义（P<0.05）。（4）福尔马林+高剂量曲马多+A-438079组大鼠自福尔马林注射后15min起各观察时间点的疼痛评分较福尔马林+高剂量曲马多组均明显升高,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论鞘内注射曲马多可通过促进vlPAG中P2X7受体表达而对炎症性疼痛大鼠产生镇痛作用。