肺癌是全球范围内高发和致命的癌症之一，2020年美国数据显示，它在男性和女性新增病例中均排名第二，占新发肿瘤的13%。肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占85%，肺腺癌是最常见的类型，超过40%。分子靶向治疗针对特定的致癌靶点，已用于多种肿瘤治疗，特别是在非小细胞肺癌中，从化疗发展到靶向特定基因突变的治疗[1]。转录因子靶向治疗在肺癌中取得进展，如p53和MDM2相互作用的抑制剂对癌症有效。ORC1在其他癌症中的作用已知，但其在肺腺癌中的角色尚不明确。本研究旨在通过生物信息学和基础实验，探究ORC1在肺腺癌中的调控机制，以期改善治疗手段和提高治疗效果。
1.ORC1 与 SLC7A1L 的理论基础
1.1 ORC1 的生物学特性
ORC1在细胞周期中起着至关重要的作用，它是起始识别复合物（ORC）的重要组成部分，ORC 是真核细胞 DNA 复制的起始蛋白，ORC1 在其中发挥关键作用。
1.1.1 ORC1 的结构与功能
ORC1由特定的氨基酸序列组成，具有一定的分子结构。它含有一个 BAH 结构域等特定结构。ORC1 作为起始识别复合物的关键亚基，在 DNA 复制起始中发挥关键作用；ORC1 以 ATP 依赖的形式结合在 DNA 复制起始点上，形成一个平台，为后续其他起始因子的结合提供基础。例如，当 ORC1 与 DNA 的复制起始位点特异结合后，CDC6、MCM 复合体等相继结合到 ORC1 上，形成复制前复合物，促进细胞由 G1 期进入 S 期，逐步完成 DNA 的复制。
1.1.2 ORC1 在肿瘤中的表达模式
ORC1表达在不同肿瘤类型中有所不同，尤其在肺腺癌中表现出特定特点。其表达水平与细胞周期相关，并可能与肿瘤进展紧密相关。与正常组织相比，肺腺癌组织中ORC1表达可能发生变化，表现为上调或下调，影响肿瘤发展。例如，ORC1高表达可能与肿瘤恶性程度和预后不良相关，而低表达可能与特定病理特征或治疗反应相关。ORC1还可能与其他基因和分子相互作用，影响肿瘤行为。
1.2 SLC7A1L 在肺腺癌中的作用
SLC7A1L 在肺腺癌中发挥着重要作用，参与了多个关键的生物学过程。
1.2.1 SLC7A1L 与谷胱甘肽代谢
SLC7A11是溶质载体家族成员，与SLC3A2形成胱氨酸/谷氨酸反转运体Xc-系统，主要负责转运功能。它参与摄取胱氨酸和释放谷氨酸，促进谷胱甘肽合成。谷胱甘肽是抗氧化剂，保护细胞免受氧化损伤，维持氧化还原平衡。在肺腺癌中，SLC7A11高表达，增强细胞摄取胱氨酸能力，促进谷胱甘肽合成，维持低水平活性氧和活性羰基化合物，为肿瘤细胞生长创造有利环境[2]。
1.2.2 SLC7A1L 与肿瘤耐药性
在胶质瘤中，SLC7A11过表达，可增加胶质瘤细胞对氧化应激的抵抗力，降低对替莫唑胺（Temozolomide）的敏感性。在黑色素瘤中，SLC7A11通过增加细胞内GSH含量，使黑色素瘤对BRAF抑制剂产生耐药性，而组蛋白去乙酰化酶抑制剂抑制SLC7A11能够显著诱导肿瘤消退。在大肠癌中，特异性SLC7A11抑制剂-柳氮磺吡啶（Sulfasalazine，SSZ），可有效增强顺铂（Cisplatin）在癌细胞内的药物含量和细胞毒性。
1.3 ORC1通过调控肺腺癌靶基因SLC7A1L的检测方法
1.3.1 稳定过表达/沉默ORC1的细胞株构建
将包装质粒、包膜质粒以及目的质粒共转染入细胞系中，转染10小时后更换为全新的完全培养基，待48小时后收集细胞上清液以制备慢病毒。随后，将细胞株接种至培养皿中，待细胞生长至融合度达到30%时，分别用重组慢病毒和对照组慢病毒进行感染。感染12小时后，移除病毒液，更换为新鲜的培养基继续培养。48小时后，向培养基中添加嘌呤霉素以执行药物筛选。经过48小时的筛选，存活的细胞即为成功被慢病毒感染的细胞。
1.3.2.CCK-8实验
在标准条件下培养上述各组细胞，将细胞接种于96孔板中，并在37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养箱中进行培养。在第0、3、5天对细胞进行处理，并执行细胞增殖能力的检测。检测过程中，首先移除孔板中的培养基，随后向每孔中加入100微升的CCK-8检测溶液，在37摄氏度的培养条件下孵育2小时。利用多功能酶标仪在450纳米波长下测定吸光度OD值，依据各组的OD值计算出相应的细胞增殖情况。
1.3.3.RT-PCR技术
利用胰蛋白酶对细胞进行裂解处理，并进行15分钟的孵育，随后向样本中添加250微升氯仿，并通过离心步骤分离出上层水相，以提取组织样本中的总RNA。在提取的总RNA基础上，运用逆转录试剂盒进行cDNA的合成。构建定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）反应体系后，利用Rotor-Gene Q Series Software检测系统执行qRT-PCR检测。检测完成后，记录各组样本的阈值循环（CT）值，并对目标基因的表达量进行统计学分析。
1.3.4 Western-blot技术
通过细胞裂解液提取组织/细胞中的总蛋白，并通过离心技术收集。采用BCA法对蛋白浓度进行定量分析。完成蛋白浓度测定后，对不同组织/细胞样本执行SDS-PAGE电泳实验。电泳过程完成后，采用转移装置将分离的蛋白条带转移到PVDF膜上。转膜操作完成后，将PVDF膜置于5%脱脂牛奶中封闭1小时，随后用TBS进行冲洗。之后，将一抗在4度条件下进行过夜孵育，随后加入HRP标记的羊抗兔抗体为二抗孵育1h。最后用化学发光成像系统对PVDF膜进行曝光检测。
1.3.5.流式细胞技术
在进行细胞周期分析的实验中，首先对各实验组细胞进行常规的培养和传代操作，随后将细胞接种至培养皿中以进行后续处理。为获取细胞样本，将各组细胞收集至流式细胞管内，并通过磷酸盐缓冲液（PBS）进行洗涤、离心以及上清液的移除。随后以逐滴方式向细胞样本中加入5毫升浓度为70%-80%的乙醇溶液，通过涡旋振荡器充分混匀细胞，之后在4℃条件下避光保存超过18小时。经过离心和清洗步骤去除乙醇后，对细胞进行碘化丙啶（PI）和核糖核酸酶（RNase）的染色处理。染色完成后，将样本在室温下避光反应15分钟，最后依据流式细胞仪的标准操作规程对各组细胞的周期分布进行检测[3]。
2.ORC1 调控 SLC7A1L 对肺腺癌病程的影响
2.1 肿瘤细胞增殖与凋亡
2.1.1 促进细胞增殖的机制
ORC1 调控 SLC7A1L 促进肺腺癌细胞增殖的途径可能涉及多个方面。首先，SLC7A1L 参与谷胱甘肽代谢，通过增强细胞摄取胱氨酸的能力，促进谷胱甘肽的合成。谷胱甘肽作为一种重要的抗氧化剂，能够维持细胞内较低的活性氧（ROS）和活性羰基化合物（RCS）水平，为肿瘤细胞的生长提供有利的环境。ORC1 可能通过上调 SLC7A1L 的表达，进一步增强谷胱甘肽代谢，从而促进肺腺癌细胞的增殖。
2.1.2 抑制细胞凋亡的作用
ORC1 可能通过 SLC7A1L 影响肺腺癌细胞凋亡，主要通过以下几种方式。一方面，SLC7A1L 参与谷胱甘肽代谢，谷胱甘肽能够保护细胞免受氧化应激的损伤，维持细胞氧化还原平衡。氧化应激是诱导细胞凋亡的重要因素之一，通过增强谷胱甘肽代谢，ORC1 调控 SLC7A1L 可以降低细胞内的氧化应激水平，从而抑制肺腺癌细胞凋亡。
ORC1 可能通过影响与细胞凋亡相关的信号通路，间接调控 SLC7A1L 对肺腺癌细胞凋亡的抑制作用。与此同时SLC7A1L 对肺腺癌耐药性有着显著影响，可能通过增强肿瘤细胞对药物的抵抗能力，间接抑制细胞凋亡。ORC1 调控 SLC7A1L 的表达，可能使肺腺癌细胞对化疗药物等的敏感性降低，从而减少药物诱导的细胞凋亡[4]。
2.2 肿瘤侵袭与转移
2.2.1 影响细胞骨架重排
细胞骨架重排对于肿瘤细胞的侵袭和转移至关重要。已有研究表明，在某些肿瘤中，特定基因的调控会影响细胞骨架的稳定性和动态变化。在肺腺癌中，ORC1 可能通过调控 SLC7A1L 进而影响细胞骨架重排。
2.2.2 调控黏附与分离过程
肿瘤细胞的黏附和分离过程在其侵袭和转移中起着关键作用。ORC1 可能通过调控 SLC7A1L 影响肺腺癌细胞的黏附和分离。一方面，SLC7A1L 参与谷胱甘肽代谢，谷胱甘肽可以调节细胞内的氧化还原状态，影响细胞表面分子的表达和功能。例如，一些细胞黏附分子的表达和活性可能受到氧化还原状态的影响。当 ORC1 调控 SLC7A1L 增强谷胱甘肽代谢时，可能会改变细胞表面黏附分子的表达和活性，从而影响肺腺癌细胞与周围组织的黏附。另一方面，细胞的分离过程也与细胞骨架的变化密切相关[5]。
3. 总结与展望
ORC1 通过调控肺腺癌靶基因 SLC7A1L 的表达，在肺腺癌的发生发展中发挥着重要作用。这一研究结果为肺腺癌的治疗提供了新的靶点和策略，有望为肺腺癌患者带来更好的治疗效果。
未来研究应深入探讨ORC1和SLC7A1L在肺腺癌中的作用。（1）研究ORC1与转录因子的相互作用及其对SLC7A1L表达的调控，利用基因编辑和蛋白质分析技术确定作用位点和模式。（2）研究DNA甲基化和组蛋白修饰在ORC1调控SLC7A1L表达中的作用。（3）开发针对ORC1和SLC7A1L的靶向治疗，如小分子抑制剂或抗体药物，并评估其在肺腺癌治疗中的效果和安全性。结合临床样本和动物模型，研究这两个蛋白在肺腺癌耐药性中的作用，为解决肿瘤耐药提供新策略。
参考文献：
[1] 张越山,陈炼,张萌. 基于加权基因共表达网络分析并验证胰腺癌增殖相关关键基因[J]. 中华实验外科杂志,2023,40(11):2331-2334.
[2] 何海填. CircRNA_100395通过调控microRNA--1228/ORC6信号轴影响前列腺癌增殖和转移能力的机制研究[D]. 广东:南方医科大学,2021.
[3] 王博. 基于生物网络控制的肺腺癌转移中药组方优化与药效机制研究[D]. 北京:中国中医科学院,2023.
[4] 陈三三. 去甲斑蝥素对激素非依赖前腺癌DU145细胞作用及其作用机制的研究[D]. 广东:南方医科大学,2013.
[5] 罗霞. 基于转录组学探讨氟苯达唑抗肝癌作用机制[D]. 河南:郑州大学,2022.
[5] 蒋新格. 二甲双胍通过下调SLC7A11、GPX4促进人肺腺癌A549细胞铁死亡[D]. 辽宁:大连医科大学,2023.
