宫颈癌（CC）是女性各类癌症中第二常见的恶性肿瘤，威胁着女性的寿命和健康。近期全球新增病例49.5万例，患者年龄层向年轻化转变。此外，患有高级别宫颈上皮内瘤变(CIN)或CC的患者(15-35%)通常在首次筛查时未被发现[1]。
人乳头瘤病毒(HPV)感染与CC之间的因果关系已被确定，已经鉴定了大量的HPV基因型，并且根据与宫颈病变的相关性将HPV毒株分为高危（HR）和低危（LR）两类。HR HPV，尤其是13 HR HPV基因组（即基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68）更常见于癌前或恶性肿瘤中。约100%的CC已被证实受到HR HPV感染。明确的科学证据表明，与基于细胞学的筛查相比，基于经过验证的致癌HPV DNA检测作为初步检查以及应用适当方案的筛查在预防侵袭性宫颈癌方面更为有效[2]。本研究的目的是检查两种市售检测（HC II检测和实时荧光PCR检测）的性能，并检测中国妇产科就诊的女性宫颈样本中是否存在HR HPV，这项研究为临床医生提供了额外的、成本更低的CC筛查选择。
1.资料与和方法
1.1资料
选取了2021年2月1日至2023年6月30日1252例接受CC筛查的妇女，患者平均年龄为40.8±9.5岁（范围：19-71）；90%的患者年龄≥30岁，其中86%为30-65岁。在访问期间，从这些妇女身上收集了用于液基细胞学检测(LCT)、HC II检测和实时荧光PCR检测的样本。当这三项检查结果≥1项异常时进行阴道镜检查，并在发现病变时采集组织学样本。表现出急性生殖器炎症的女性被排除在本研究之外。
1.2方法
（1）样品采集：要求女性在就诊前3天避免阴道冲洗、阴道给药，并在就诊前24小时避免性活动。在采集宫颈细胞时，我们首先用棉签清洁并擦亮宫颈。其次，在月经周期的任何一天（月经出血期间除外），用宫颈刷旋转3次来获取宫颈样本。我们从刷子上取出样本，将其放入装有保存液的样本管中，并标记患者的姓名和日期。样本在2–8°C下保存<24小时或在-20°C下保存30天。避免重复样本解冻。
（2）长链CT：涂片采用AutoCyte Prep染色机染色，并由具有细胞学诊断能力的专业妇科病理医生观察。细胞学诊断按照国际癌症协会2001年Bethesda系统的宫颈细胞学标准进行。根据该系统，宫颈鳞状上皮异常包括非典型鳞状细胞（ASC）、低度鳞状上皮内病变（LSIL）和高度鳞状上皮内病变（HSIL）以及鳞状细胞癌（SCC）。
（3）使用HC II测试进行HPV DNA测试：HR HPV DNA检测使用自动化HC II检测（Qiagen，盖瑟斯堡，马里兰州，美国）进行。HC II测试是一种夹心捕获分子杂交测定，利用化学发光检测提供半定量结果。该测试经过校准，可检测约5,000个基因组/ml的目标HPV等价物，其表示为相对光单位(RLU)测量值大于或等于每次运行中通过一系列标准计算的截止值。小于截止值的测量结果被评分为阴性。分析样本中是否存在HR HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型。3个阳性对照和3个阴性对照（由制造商提供）包含在每次运行中。
（4）使用实时荧光PCR检测进行HPV DNA检测：该测定包括：i)DNA提取，涉及通过在蛋白酶存在下、高温变性条件下裂解宫颈标本来释放HPV和细胞DNA。该测定不需要DNA纯化。ii)PCR扩增和杂交反应，涉及使用生物素化引物，以确定HPV基因组多态性L1区域内长度约150 bp的序列。引物汇集在相同的PCR Master mix中，旨在从HC II测试中包含的相同13 HR HPV类型中扩增病毒DNA。代表扩增序列内部区域的捕获探针被用来识别人类DNA的HPV。使用Roche LightCycler®进行PCR扩增和杂交反应。同时检测30份细胞学样本，每次均设立阴性和阳性对照。反应完成后，Roche LightCycler®使用计算机计算每个样本的循环阈值（CT）。CT为各反应荧光信号达到设定阈值的循环数。iii)结果解释涉及基线和阈值超过阴性对照扩增曲线的顶点，而CT值不表明检测（空白）。反应有效性的评估取决于空白阴性对照和阳性对照的CT≤36。当样品的CT值≤40时，样品被评价为阳性，而CT>40的样品被认为是阴性。根据制造商的说明，该测试能够以5,000拷贝/ml的水平检测13种HR HPV类型的基因型。
（5）阴道镜检查和活检：对HR HPV阳性或细胞学异常或两者兼有的女性进行宫颈阴道镜检查。阴性细胞学结果和使用的两项HR HPV DNA测试预测宫颈肿瘤的风险较低。鉴定病变时获取组织学样本，在正常转化区3°、6°、9°和12°处获取4个组织学样本。阴道镜检查不合格时行宫颈管刮宫术。对高度病变的患者进行环形电切术（LEEP）、冷刀锥切术（CKC）或子宫切除术以进一步诊断和治疗，最严重的诊断被确定为最终的组织病理学诊断。
1.3观察指标
根据所使用的两种HPV检测和组织病理学结果的组合，根据推测的HPV状态确定实时荧光PCR检测、HC II检测和LCT的敏感性、特异性和准确性。
1.4统计学方法
本研究的所有数据均使用SPSS 26.0统计学软件进行处理，计量资料使用均值±标准差表示，组间比较采用t检验，计数资料使用n(%)表示，组间比较分析采用X2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.结果
2.1使用HC II测试和实时荧光PCR检测检测1,252份样本的结果
1,252份标本的HC II检测与实时荧光PCR检测的比较见表1。在研究的1,252名女性中，两项测试对1,155个样本给出了相似的结果，总体一致性程度为92.25%，表明一致性非常好。然而，使用这两种测试对97个样品进行的检查得出了不一致的结果。这些样本的HPV基因分型将在未来的研究中进行。假设使用这两种测试检测出阳性结果的样本被HR HPV感染，而结果为阴性的样本是HR HPV阴性或被LR HPV感染，则可以评估所使用的两种测试的“条件”敏感性和特异性（P <0.05），详见表1。
表1使用HC II测试和实时荧光PCR检测检测的1,252个样本的结果比较分析表
2.2组织病理学结果与HPV检测之间的相关性
共有477名患者接受了阴道镜检查和活检。组织病理学结果被认为是“金标准”。Sherman等发现，当宫颈细胞学检查未检出CIN或CC和HPV阴性病例时，累积发病率仅为0.79%，而这些组织病理学样本中未发现CIN和癌症病例。基于这些理由，LCT结果正常且两次HR HPV DNA检测结果呈阴性的女性被归类为“阴性”组（没有CIN或CC的女性）。11015份标本的组织病理学结果为阴性（正常或炎症）。在这些样本中，HC II检测有182个（17.93%）呈阳性，而实时荧光PCR检测有162个（15.96%）呈阳性。此外，56例样本经组织病理学检查诊断为CINI，其中HC II检测27例（48.21%）呈阳性，实时荧光PCR检测29例（51.79%）呈阳性。我们比较了组织病理学阴性组和阳性组，当使用HC II测试检查样本时，HR HPV感染率分别为19.51%和94.48%。观察两组间差异有统计学意义（χ2=411.57；P<0.05），详见表2。
在本研究中，共有181名CINII+患者，其中94.48%的HC II检测呈阳性，其中92.82%的实时荧光PCR检测呈阳性。在组织病理学阴性组的1071份样本中，HC II检测有862份（80.49%）阴性样本，实时荧光PCR检测有880份（82.17%）阴性样本。在使用HC II测试的872个阴性样本中，有862名患者没有CINII+，表明阴性预测值为98.85%。在使用实时荧光PCR检测的893个阴性样本中，有880名患者没有CINII+，表明阴性预测值为98.54%。
表2组织病理学结果与HPV检测之间的相关性比较分析表
3.讨论
HR HPV感染与CC之间的因果关系已经确定。Sharma等人认为，针对35岁以上女性进行基于人群的HPV调查足以估计某个国家的CC风险。本研究显示正常组或炎症组与CINII+组HR HPV感染率存在差异（P<0.05）。
可利用多种方法来检测HR HPV感染。HC II测试被认为是筛查CC的最佳方法。实时荧光PCR是一种使用TaqGold™DNA聚合酶开发的新型检测方法，可最大程度地减少非特异性扩增量并提高检测灵敏度。此外，该PCR方案基于5'-核酸外切酶测定和荧光积累的实时检测。每个扩增循环期间的荧光释放与生成的扩增子的量成正比。因此，它被认为是估计病毒载量的准确方法[3]。
本研究的目的是比较：i)两种市售检测（HC II检测和实时荧光PCR检测）的性能，它们涵盖相同的HR HPV基因型，用于检测13种HR HPV类型，以及ii)在1252名女性中进行CINII+筛查的两项测试的敏感性、特异性和准确性。两次检验的总体相关率为92.25%，一致性较好。然而，97个样本产生了不同的结果（占所有样本的7.75%）：59个样本使用HC II测试呈阳性，使用实时荧光PCR检测呈阴性。在这59名女性中，10名被诊断为CINII+，38名使用实时荧光PCR检测呈阳性，使用HC II检测呈阴性。在这38名女性中，8名患者被诊断为CINII+。
本研究表明实时荧光PCR检测具有上述特点。该检测检测CINII+的灵敏度为92.82%，阴性预测值为98.54%。实时荧光PCR检测的另一个特点是其卓越的品质和合理的价格，其花费仅为HC II检测的一半。因此，它可以减少发展中国家的CC筛查费用。然而，由于它具有扩增较短片段的能力，因此被认为具有较高的分析灵敏度和较低的临床特异性，并且适用于保存不太完好的标本。
综上所述，本研究表明，实时荧光PCR测定和HC II测试很容易在临床实验室中实施，并且它们提供的结果具有可比性。尽管这项研究发现这两种测试之间存在一些适度的差异（这一事实将在未来的研究中进一步研究），但它为妇科医生提供了CC筛查的额外、低成本选择。
参考文献：
[1]黄晓叶.实时荧光定量多聚核苷酸链式反应在高危型人乳头瘤病毒诊断中的应用价值[J].医疗装备,2021,34(08):31-32.
[2]王晓明,戴卫健,余道军等.多重实时荧光定量PCR方法在高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA检测中的应用[J].临床检验杂志,2020,38(11):841-844.
[3]严良烽,谢超,方景文.基于分子生物学水平的核酸实时荧光定量聚合酶链反应人乳头瘤病毒基因分型检测技术的临床应用[J].实用医技杂志,2020,27(09):1170-1171.
