竹黄是仅见于我国及日本的珍稀中医药用资源。现代药物化学分析表明，竹黄含有多种生物活性成分，如苝醌类化合物、麦角甾醇、竹黄多糖等。众多的活性成分使得竹黄具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒和镇痛局麻等多种功能[1]。有研究证明,竹黄提取物中的竹黄色素A可阻断生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化，抑制新生血管形成，提示竹黄色素A可能是竹黄治疗类风湿性关节炎的有效成分之一[2]。在类风湿性关节炎的发生发展过程中，TNF-α对关节滑膜炎的发病进展有着重要作用，其可通过自分泌或旁分泌方式有效诱导IL-6、IL-8等多种炎性因子以及刺激成纤维细胞表达细胞粘附分子-1等粘附分子来促进炎症的发展和转移，从而加重患者病情。而通过TNF-α竹黄提取物共孵育培养发现，竹黄提取物能够显著抑制对TNF-α所介导的炎症反应，并可抑制TNF-α诱导的NF-κB蛋白表达水平，从而阻断TNF-α通路，减轻炎症反应[3]。基于此，本研究通过索氏提取法和聚酰胺柱层析法相结合分离出竹黄中的活性抗炎成分，以小鼠成纤维细胞L929细胞株为模型采取梯度浓度培养的方法筛选出具有生物活性的组分并确定50%抑制率浓度(IC50)，Hoehest荧光染色观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞凋亡；以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为模型检测竹黄作用后细胞内粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、E-选择素及IKK-α和NF-κB p65的表达，探索竹黄对TNF-α介导的炎症反应的影响。旨在为慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病的治疗寻找新的药物和靶点。现报告如下。
1.材料与仪器
竹黄，购自樟树市中药城；超净工作台（ThermoFisher）、超低温冰箱（ThermoFisher） 购自美国ThermoFisher；CO2培养箱 C-880V购自德国；荧光显微镜 Nikon 购自日本尼康；制冰机 UBE30-10、纯水仪 E-PURE购自德国Ziegra；蛋白质纯化系统 ABIprims-7000、真空印迹转移仪 Bio Rad 购自美国Bio-Rad；电泳仪购自中国六一；电泳转移槽购自美国Bio-Rad；酶标仪、分析天平购自德国\Storius；低温高速离心机购自中国兴华；高压灭菌锅 购自日本Sanyo；1640培养液、胎牛血清 购自美国Hyclone；NF-κB逆转录试剂盒购自美国invitrogen；NF-κB P65抗体购自Abbkine；鼠抗β-Actin抗体购自碧云天。等。
2.方法
2.1竹黄活性成分提取
称取干燥竹黄200g，使用微型植物粉碎机粉碎，过50目筛，获得竹黄粗粉；之后取竹黄粗粉置于70℃纯水抽提2次 (第一次8倍量，第二次6倍量) ，每次12小时。合并水提取液，减压回收至80ml，加乙醇至醇浓度为80%， 静置6小时，抽滤，得滤渣D，水提后药渣部分用80%乙醇回流提取2次(均为6倍量)，合并醇提取液，减压回收溶剂得流浸膏，聚酰胺柱层析，分别以水、40%乙醇、95乙醇洗脱，减压回收溶剂，分别得水洗部分C、40%醇洗部分A和95%醇洗部分B。精确称量A、B、C、D各28mg，50%乙醇溶解并定容至14ml，22μm滤器过滤，配制成2mg/ml储存液，4℃保存。根据实验要求梯度稀释。
2.2MTT法检测药物作用后细胞生长情况
将小鼠成纤维细胞L929以1x105-2x105cell/瓶接种于细胞培养瓶，用含有10%灭活小牛血清、1%双抗的RPMI1640培养基常规培养。细胞培养在37℃恒温、5%CO2及饱和湿度的培养箱中进行。而后用0.25%胰蛋白酶消化处于对数期生长的细胞，离心，弃上清，调整细胞悬液浓度至8x104cell/ml左右，100ul/孔接种于96孔板，空白组不接种细胞，只加入等量的新鲜培基，在37℃、5%CO2及饱和湿度的恒温培养箱中进行培养。细胞贴壁之后，吸掉孔中的培养基，加入含有各浓度组药物的培养基。每组设6个平行复孔，空白组和对照组只加入等量的新鲜培基，置于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中继续培养48小时。 药物作用48小时后，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20ul，继续培养4小时后终止培养，小心吸去孔内培基。之后每孔加入150ul 二甲基亚砜(DMSO)，室温低速震荡15min，在酶标仪OD490nm处测量各孔吸光度值。按公式计算每孔的细胞生长抑制率：细胞生长抑制率=1-（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）*100%，计算各药物组分的IC50。
2.3以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为模型检测竹黄作用后细胞内粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、E选择素及IKK-α和NF-κB p65的表达
实验分组：正常培养组、TNF-α组、TNF-α+药物组。
检测细胞上清液中粘附分子表达 用ELISA法检测各组培养上清液中细胞内粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、E选择素的表达，实验操作严格按照说明书进行。
q-PCR和Western Blot检测NF-κB基因表达
NF-κB mRNA检测：引物设计NF-κB上游引物：5'-CGCA TCCA GACCAACAACA-3'，下游引物：5'-TGCCCAGAA GGAAACACCA-3'，内参为GAPDH。实验操作严格按照说明书进行。
2.6 IKK-α、NF-κB P65检测 提取人脐静脉内皮细胞蛋白，测定蛋白质浓度。经电泳、转膜、封闭、一抗二抗孵育后，进行化学发光法显色，曝光显影。用 Quantity One 分析软件，对显影条带进行灰度分析，将目的蛋白与β-Actin灰度值的比值，作为目的蛋白的相对表达。
3.统计学分析
所有数据均采用SPSS 24软件进行分析，计量资料以均数±标准差（`x±s）表示，两组计量数据之间比较采用t检验，多组数据之间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05表示具有统计学差异。
4.结果
4.1 MTT法检测药物作用后细胞生长情况
MTT法检测发现，相比于实验组，空白组和对照组的IC50值显著更高，且抑制率显著更低，P＜0.05。表明竹黄提取物的细胞毒性较小，且对TNF-α诱导的L929细胞生长抑制具有显著作用。见表1。
表1 MTT法检测药物作用后细胞生长情况分析
注：与实验组比较，*P＜0.05。
4.2 ICAM-1、VCAM-1、E选择素、IKK-α、NF-κB p65和NF-κB mRNA的表达检测
与正常培养组相比，TNF-α组和TNF-α+药物组的ICAM-1、VCAM-1、E选择素、NF-κB p65的表达水平均显著更高，而IKK-α和NF-κB mRNA的表达水平显著更低，P＜0.05；但与TNF-α组相比，TNF-α+药物组的ICAM-1、VCAM-1、E选择素、NF-κB p65的表达水平则显著更低，而IKK-α和NF-κB mRNA的表达水平显著更搞，P＜0.05。表明竹黄提取物对TNF-α诱导炎症反应具有抑制作用。见表2。
表2 ICAM-1、VCAM-1、E选择素、IKK-α、NF-κB p65和NF-κB mRNA的表达检测分析
注：与TNF-α组比较，*P＜0.05；与TNF-α+药物组比较，#P＜0.05。
5.讨论
目前，临床对于TNF-α介导的炎症通路已经有了较为明确的了解，其主要是通过TNFR1和TNFR2两个跨膜受体来完成。其中TNFR1激活后可与TRADD 、RIP、TRAF2 和cIAP1结合形成复合物，从而激活NF-κB和AP-1介导炎症反应；而TNFR2激活可与TRAF2、TRAF3、cIAP1\2结合形成复合物，并通过MARK3途径和NIK途径分别激活转录因子AP-1和NF-κB，从而诱导炎症反应。而在类风湿性关节炎滑膜组织中，浸润的炎性细胞、血管内皮细胞、增生细胞的胞质和胞核内均有NF-κB大量表达[4]。因此，NF-κB是类风湿性关节炎发生发展的主要通路。
转录调节因子(NF-κB)是一种重要的核转录因子，几乎存在于所有的细胞中，其可与特定的κB序列结合,启动和调控众多参与炎症过程的细胞因子的基因表达。在类风湿性关节炎炎性反应的复杂细胞因子网络中,一起到中枢调节物的作用。此外，NF-κB在活化过程中还可够活化IKK(IκB激酶)复合物，而IKKβ可使与P65-P50二聚体结合的IκB磷酸化，并将其降解，使P65-P50二聚体进入细胞核，与DNA上的特定位点(κB位点)结合，而后细胞编码多种细胞因子，参与炎症反应[5]。研究表明，NF-κB可以通过调节IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、粘附分子及多种酶的基因表达，参与机体免疫调节和炎性反应,并在细胞增殖，分化及凋亡方面起关键作用[6]。而目前有研究显示，竹黄提取物能显著抑制TNF-α诱导NF-κB的高表达,而且还具有一定的浓度依赖性。这一结果提示,竹黄提取物可能通过影响TNF-α通路抑制NF-κB的活性,而NF-κB活性的变化又能降低和减弱其正反馈作用,该作用可能正是竹黄治疗类风湿性关节炎的机制[7]。
通过本研究我们发现，相比于实验组，空白组和对照组的IC50值显著更高，且抑制率显著更低，P＜0.05。表明竹黄提取物的细胞毒性较小，且对TNF-α诱导的L929细胞生长抑制具有显著作用。与正常培养组相比，TNF-α组和TNF-α+药物组的ICAM-1、VCAM-1、E选择素、NF-κB p65的表达水平均显著更高，而IKK-α和NF-κB mRNA的表达水平显著更低，P＜0.05；但与TNF-α组相比，TNF-α+药物组的ICAM-1、VCAM-1、E选择素、NF-κB p65的表达水平则显著更低，而IKK-α和NF-κB mRNA的表达水平显著更高，P＜0.05。表明竹黄提取物对TNF-α诱导炎症反应具有抑制作用。
综上所述，我们认为竹黄提取物可能是通过阻断NF-κB通路，血清黏附分子产生，降低IKK活性等途径来在抑制TNF-α诱导的炎症反应，从而帮助患者治疗疾病。
【参考文献】
[1]钟琪等, 真菌竹黄化学成分及药理活性研究进展. 世界最新医学信息文摘（连续型电子期刊）, 2020.20(44).
[2]赵宁与陈双林, 竹黄遗传多样性与竹红菌素合成和抗癌作用的研究进展. 生物技术通报, 2018. 34(04):16-23.
[3]Steeland, S., et al., Counteracting the effects of TNF receptor-1 has therapeutic potential in Alzheimer's disease.EMBO Mol Med, 2018. 10(4).
[4]. Masaki, I., et al., Structural optimization of a TNFR1-selective antagonistic TNF-α mutant to create newmodality TNF-regulating biologics. The Journal of biological chemistry, 2020.
[5]. Yang, M., et al., Optimizing TNFR2 antagonism for immunotherapy with tumor microenvironment specificity. JLeukoc Biol, 2020. 107(6): p. 971-980.
[6]Ying, L., et al., Clostridium difficile toxin B induces colonic inflammation through the TRIM46/DUSP1/MAPKs and NF-κB signalling pathway. Artificial cells, nanomedicine, and biotechnology, 2020. 48(1).
[7]Refaat A, E., et al., Exendin-4 Ameliorates Cardiac Remodeling in Experimentally Induced MyocardialInfarction in Rats by Inhibiting PARP1/NF-κB Axis in A SIRT1-Dependent Mechanism. Cardiovascular toxicology,2020. 20(4).