小儿氨酚黄那敏颗粒是目前常见的非处方药物，是儿科感冒中的常用感冒药物，在多年的市场调查中存在优越的感冒治疗效果，主要适用于儿童普通感冒引起的鼻塞、咽喉疼痛、流鼻涕以及打喷嚏等症状。这种药物主要有乙酰氨基酸、人工牛黄等成分组成，通过国家现行标准对小儿氨酚黄那敏颗粒中人工牛黄、体外培育牛黄进行测定，其中研究还比较少。目前，人工牛黄主要是由胆酸、胆红素、牛胆粉、胆固醇等组成的，其中胆酸、胆红素以及猪去氧胆酸是最为主要的成分，也是人工牛黄和体外培育牛黄对比的重要因素。在当今社会发展中，各种化学元素、化学成分检验检测技术不断涌现，在小儿氨酚黄那敏颗粒中胆酸、猪去氧胆酸和胆红素的主要测定方法有糠醛比色法、紫外可见分光光度计、HPLC、TLC等，本文研究中采用了TCL测量胆酸、猪去氧胆酸；用HPLC测量胆红素，具体报道如下。
1、仪器与试剂
Ultimate3000型双三元高效液相色谱仪(美国THERMO公司,含CAD检测器);XS205DU型电子天平(METTLERTOLEDO国际股份有限公司,最大载荷81g/220g,分度值0.01mg/0.1mg);KQ-300V型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);MIKRO22R型高速冷冻离心机(德国HET-TICH公司)。甲醇为色谱纯,水为纯化水,其他试剂均为分析纯。
2、方法与结果
2.1人工牛黄和体外培育牛黄的TLC鉴别
2.1.1薄层色谱条件
薄层板为硅胶G板(青岛海洋化工厂)，展开剂为异辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸(15∶7∶5)，点样量为5μL，展开后晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯(365nm)下检视。
2.1.2对照品溶液的制备
分别称取胆酸和猪去氧胆酸适量，加甲醇制成每1mL中含1mg的混合对照品溶液
2.1.3样品溶液的制备
取本品细粉适量(约相当于人工牛黄20mg)，加三氯甲烷50mL，超声处理30min，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。
2.1.4阴性对照的制备
除去人工牛黄或体外培育牛黄，模拟处方(分别取各辅料的最大量)按样品溶液的制备方法，制成阴性对照液。
2.1.5样品测定结果
对照品溶液在紫外灯(365nm)下检视可见2个蓝紫色荧光斑点，分离度良好。A和B企业采用体外培育牛黄仅检出胆酸，其他企业均检出胆酸和猪去氧胆酸。这与人工牛黄和体外培育牛黄的组成完全吻合。该方法可以快速地区分是否采用体外培育牛黄。
2.2人工牛黄和体外培育牛黄中胆红素的HPLC法测定
2.2.1色谱条件
AgilentZOBAXC18色谱柱(4.6mm×200mm，5μm);流动相为甲醇-三氯甲烷-0.1%磷酸(88∶6∶6);检测波长449nm;进样量10μL;体积流量1.0mL/min;柱温30℃。
2.2.2对照品溶液的制备
精密称取胆红素对照品10mg，置100mL棕色量瓶中，加三氯甲烷-甲醇-水-盐酸(90∶10∶0.3∶0.03)混合液适量，超声使胆红素溶解并稀释至刻度，摇匀;再精密量取2mL，置25mL棕色量瓶中，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.2.3供试品溶液的制备
取本品5袋内容物，置100mL锥形瓶中，精密加三氯甲烷-甲醇-水-盐酸(90∶10∶0.3∶0.03)混合液25mL，称定质量，超声提取20min，取出，迅速冷却至室温，再称定质量，用上述混合液补足减失质量，摇匀，滤过，作为供试品溶液。
2.2.4空白溶液的制备
按处方比例，按供试品溶液的制备方法，制备不含人工牛黄或体外培育牛黄的空白样品。
2.2.5专属性试验精密量取对照品溶液、供试品溶液及空白样品溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，对照品溶液与样品溶液主峰的保留时间一致，其他共存组分(对乙酰氨基酚和马来酸氯苯那敏)及空白样品溶液均对测定胆红素无干扰。见图1。
图1对照品和样品色谱图
2.2.6线性关系
取“2.2.2”项下对照品贮备液逐级稀释，按照“2.2.1”项色谱条件测定，以各组分峰面积为纵坐标对相应的质量回归绘制标准曲线，y=19.077+6697.3x，r=0.9992，表明在0.01～0.1mg/mL范围内线性关系良好。
2.2.7精密度试验
取对照品溶液10μL，按上述色谱条件重复进样5次，测定峰面积，胆红素峰面积的ＲSD为0.8%(n=5)。
2.2.8重复性试验取C厂样品按“2.2.3”项下方法制备供试液，平行制备5份，进样10μL测定，胆红素的含有量平均值为0.0282mg/袋，ＲSD为0.6%(n=5)。
2.2.9稳定性试验
取C厂样品溶液，于避光阴凉处放置，2h为稳定。
2.2.10加样回收率试验
称取已测定含有量的C厂样品(2.5袋)，平行9份，分别精密量取胆红素对照品贮备液1.6、2、2.4mL，回收率均在98.6%以上。
2.2.11样品测定
对8个厂家的样品进行胆红素的定量测定，以标准曲线法计算，结果见表1。
3、讨论
由于现行标准中主要以显色反应来鉴别人工牛黄中的胆酸含量，在实际检测中经常因各个企业添加辅料种类、用量的不同，导致鉴别中胆酸含量所显示的颜色存在很大的差异，有的颜色深浅不一，有些甚至是出现颜色不同的现象，如有些呈蓝紫色、有些呈浅黄色等，给鉴别工作的开展带来很大的影响。本实验中采用了TLC鉴定法测量胆酸、猪去氧胆酸，这种方法在应用中能够快速的判断出人工牛黄和体外培育牛黄的区别，避免有些不法生产商以人工牛黄来毛虫体外培育牛黄现象的发生，保证了药物药效和用药安全。
无论是人工牛黄还是体外培育牛黄都含有大量的胆红素，并且以胆红素含量的多少来判断牛黄的价格。根据相关实验研究表明，体外培育牛黄中胆红素的含量要超过人工牛黄的十倍以上，因此通过在试验中对胆红素含量进行分析，并且规定其中的含量为0.027mg和0.27mg,根据表1所示，可见目前现行标准并没有对胆红素给予明确的规定，造成企业在生产药物的时候存在胆红素投入或多或少的现象。
由于人工牛黄和体外培育牛黄在应用中并没有对胆红素进行科学的控制，这也导致了目前市场上的牛黄存在以次充好的现象比较多。为此本实验采用HPLC测定牛黄中的胆红素，有着操作方便且能够快速区分人工牛黄和体外培养牛黄的优势，效果明显，值得研究。
参考文献
[1]张梦轩,张轶华,张越,等.HPLC法测定4种感冒药制剂人工牛黄或体外培育牛黄中的胆红素[J].中成药,2017,39(9):4.
[2]刘淑,徐晨霞,孟亚飞,等.牛黄降压胶囊中体外培育牛黄的替代使用研究[J].现代药物与临床,2020,35(8):4.
[3]陈颖,胡晓茹,程显隆,等.天然牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄中胆汁酸类成分及其在人肠源Caco-2细胞模型中吸收转运的对比研究[J].数字中医药（英文）,2018,1(4):11.