骨骼肌是人体最大的组织和器官系统，约占人体质量的40%～50%，协助完成各种肢体活动，其中股四头肌是股骨前侧唯一的肌肉，也是人体最大、最有力的肌肉之一，对维持膝关节稳定、人体站立及跨步均起重要作用[1]。然而，随着人们的生活水平提高，由挫伤、碰撞、劳损、高强度不适当运动等引起的肌肉损伤成为最常见的损伤之一，肌肉损伤后由于瘢痕组织形成、肌肉组织的纤维化，导致肌组织的弹性和正常生理功能失常，严重影响并危害人们的工作与生活质量。推拿按摩是我国传统医学中有着数千年的临床实践经验的治疗手段，以滚法为代表的推拿手法作用于损伤的骨骼肌，能够有效缓解骨骼肌的痉挛，使粘连松解，其理筋整复、疏通气血、调理经络的作用对于骨骼肌损伤导致的疼痛能够有显著的缓解效果[2-3]。推拿治疗骨骼肌损伤临床报道较丰富，但也明显存在着一些问题。虽然有学者已经开始着手研究推拿作用机理，并发现按摩疗法可减轻骨骼肌损伤后肌细胞的炎症反应，减轻肌细胞坏死，减少瘢痕形成，加速肌肉组织修复[4]。但对于推拿治疗骨骼肌损伤疾病的作用机制的不明确和对疗效评估客观标准的缺乏一直严重阻碍着推拿学科发展。因此，该研究就中医推拿滚法手法对股四头肌损伤治疗效果进行如下分析，现报道如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象：2021年2月-2022年2月期间，对30只健康SPF级成年新西兰大耳白兔进行研究，入组研究大鼠雌雄各半，体重2.5-3.0 kg，月龄3月，饲养环境温度20～25℃，湿度50%～70%。
1.2 造模方法：采用自制重力铅锤打击兔右后肢股四头肌肌腹中段，建立股四头肌损伤模型。造模前1d，对新西兰大白兔右后肢进行剪毛处理。建模时，先将家兔处仰位平置，露出股四头肌及相邻肌肉部位；选定右后肢内侧股四头肌肌腹中段为打击中心，先垫一层纱布防止皮肤损伤；用自制重力铅锤，沿PVC硬塑料导向管自由下落（落高50cm），同一部位连续打击3次。肉眼可见受打击的部位出现肿胀和淤血，类似肌肉受撞击损伤，7天后模型建立成功。
1.3 分组及干预
（1）分组方法：用随机数字表将健康组、模型组（股四头肌损伤白兔）、干预组（应用推拿滚法干预）各纳入10只白兔。
（2）模型组干预方法：从造模后第8天开始，对手法组家兔进行局部滚法治疗，空白组和模型对照组不进行操作。先将家兔处仰卧位平置固定于实验台，露出股四头肌及相邻肌肉部位，以第五掌指关节背侧吸附于体表施术部位实施滚法。操作方法参考十二五普通高等教育本科国家级规划教材《推拿手法学》。①姿势放松：沉肩：肩部放松，不可耸肩，使上臂中部距离胸壁约一拳远；垂肘：肘部下垂，肘关节屈曲约120-140度；松腕：手腕放松；指舒：掌指关节自然屈曲，五指自然收拢或散开。②着力吸定部位：滚法作用力的部位，为第五掌指关节尺侧缘至第三掌骨围成的三角形，大小约占手背1/3。吸定为第五掌指关节背侧或手背近小指侧部分。③分解动作：肘关节为支点，前臂主动作推旋运动，带动腕关节屈伸：前臂外旋（旋后）配合逐渐屈腕、前臂内旋（旋前）配合逐渐伸腕，前后滚动形成滚法的复合动作。④滚动时幅度控制在120°，即腕关节屈曲时向外滚动约80°，腕关节伸展时向内滚动约40°。前滚和回滚时着力轻重之比为3： 1，峰值压力500g重力。操作频率140次/分。⑤每次操作3分钟，每天上午/下午共两次，共治疗3天。
1.4 指标收集：ELISA双抗体夹心法检测血清中白介素1（IL-1β）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、一氧化氮（NO），具体步骤如下：（1）标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别。加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为24μg/L ，16μg/L， 8μg/L，4μg/L， 2μg/L）；（2）加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；（3）温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；（4）配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用；（5）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；（6）加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；（7）温育：操作同（3）；（8）洗涤：操作同（5）；（9）显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；（10）终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）；（11）测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
1.5 统计分析：用SPSS22.0软件进行统计。计量资料（x̄±s）组间比较用F检验，两两分组比较用SNK-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 三组白兔干预后血清炎症因子含量的比较
如表1显示，与健康组相比，模型组和干预组股四头肌损伤白兔血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、NO水平显著升高（P<0.05），与模型组相比，干预组的股四头肌损伤白兔血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、NO水平显著下降但仍较健康组升高（P<0.05）。
表1 三组白兔干预后血清炎症因子含量的比较（pg/ml，x̄±s）
注：*P < 0.05
2.2 干预组白兔干预前后基本状态
研究全程无白兔发生死亡，干预前该组白兔患肢肌肉出现不同程度萎缩，患肢关节拉伸受限，患肢跛行且活动量减少，进食所有减退，结合血清炎症因子变化特征，可初步证实造模成功。干预后白兔恢复自由活动，步态无明显异常，结合血清炎症因子变化特征，初步确证应用推拿滚法干预的有效性。
3 讨论
股四头肌损伤是生活中常见损伤之一，包括机械性损伤，生化毒素，挤压伤、过度负荷、拉伤、挫伤等[5]。无论哪种原因造成的损伤，早期均表现为损伤部位的炎症反应：损伤、坏死的肌纤维释放促炎信号，诱导外周炎症细胞（以中性粒细胞、单核/巨噬细胞为主向损伤肌组织的移动及肌内浸润，以吞噬坏死肌细胞和崩解的组织碎片，同时分泌多种细胞因子和趋化因子，如IL-6、IL-8和TNF-α等，来维持肌内炎症反应并激活肌卫星细胞，活化的成肌细胞持续增殖、分化形成新的肌管以修复损伤的肌纤维，完成肌肉再生[6-8]。虽然，肌内的炎症反应有助于损变肌纤维的清除，炎性环境也有助于肌纤维的再生修复[9]。但是，剧烈、持续的肌内炎症反应易导致肌组织局部血肿或肿胀、肌内压力增加，抑制成肌细胞增殖甚至损伤正常的肌纤维，导致愈合期延长、甚至出现癫痕性修复[10]，影响患者的生存质量。因此，协调肌内炎症和肌再生的关系，探讨调控肌内炎症的分子机制，有助于深入理解并处理股四头肌损伤性炎症反应，从而促进肌损伤修复。本研究发现，股四头肌损伤后，血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、NO水平表达水平显著升高，推测其机制是肌肉组织损伤会造成肌细胞调亡或坏死，局部的炎性组织会出现组织液和血浆蛋白渗出以及细胞浸润，进而产生许多炎性因子，导致相关炎症因子的表达水平明显升高[11-14]。
滚法由丁季峰先生始创，由一指禅推拿流派原有的滚法发展而来，是为滚法推拿派的标志性手法，它以经络学说为指导衍化出多种手法，技巧性较强，具有刺激力量强、刺激面广的特点；凡虚损瘀阻型、外伤瘀阻型及风寒湿杂至所致之痹证均可运用。手法所到之处有温分肉、充肌腠、散壅痹之功，适用于颈项、肩背、腰臀和四肢等肌肉丰厚部位。滚法在临床上被广泛应用于神经系统、运动系统疾病和软组织损伤等方面，疗效确切[15-16]。本研究发现，在应用推拿滚法干预后，血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、NO水平表达水平较模型组显著降低，其原因可能是滚法在行气活血机制上的作用机制有关：一是推拿前后可以使血流变发生改变，改善局部血液循环；二是滚法刺激通过改变局部血管的形态、弹性及周围肌张力，使血管壁切应力，从而对血管的内皮细胞和平滑肌细胞等产生影响，促使细胞内Ca2+增多，并通过对Ca2+敏感的蛋白激酶使一氧化氮合成酶活性增强，产生更多NO，而NO作为力学信号分子，参与激活肌卫星细胞，促进其分化融合并维持一定数量的成肌细胞，从而达到行气活血的目的[17-18]。因此，协调肌内炎症和肌再生的关系，探讨调控肌内炎症的分子机制，有助于深入理解并处理股四头肌损伤性炎症反应，从而促进肌损伤修复。
与健康组比较，干预组在肌肉损伤恢复过程中血清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、NO仍维持高表达水平，说明在此模型的干预下炎症反应及组织修复的过程还尚未完成。综上，推拿滚法能通过调节IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和NO炎性细胞因子的表达水平，减轻股四头肌炎症反应，最终改善受损股四头肌组织。结合实验操作经验，我们发现推拿滚法作用时间和力度对股四头肌损伤白兔病的原发病灶的康复干预效果可能也会产生区别性影响，基于此点提示我们后续研究可通过改变推拿滚法的作用时间和作用力度对炎症因子表达水平的影响来深入探讨二者的关系。同时，本实验对细胞炎症因子的检测指标较为单一，在今后的研究中可以通过HE染色病理切片来观察股四头肌损伤在滚法的作用下其病理变化，还可以通过免疫组化来检测细胞炎症因子的在哪些细胞中呈阳性表达并做量化统计，分析阳性表达的细胞与组织修复的关系，以便进一步阐明滚法的治疗机制。
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