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牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)间接原位杂交PCR检测方法的建立与初步应用 下载：88 浏览：506

李亚楠1，2 白昌明2 刘金兰1 辛鲁生2 李晨2 刘莉2 黄博闻1，2 魏智薪2 王崇明2 《水产研究进展》 2019年4期

摘要:
为建立实现牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在贝类宿主组织中的精确定位方法，基于原位杂交PCR (ISPCR)技术建立了OsHV-1的间接原位杂交PCR (indirect ISPCR)检测方法，并利用该方法对OsHV-1在魁蚶主要器官的分布情况进行了检测和分析。首先选择适合原位杂交PCR的引物，在载玻片上实现对原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增，然后与使用相同引物制作的地高辛标记核酸探针进行原位杂交，最后通过免疫酶标技术显示样本内OsHV-1的组织分布。为了达到最佳检测效果，对间接ISPCR的扩增循环数以及组织消化的蛋白酶K浓度进行优化。结果显示，最适PCR扩增循环数为20，蛋白酶K浓度为20μg/mL。利用经优化的间接ISPCR检测方法，对OsHV-1在魁蚶外套膜、鳃、肝胰腺、斧足和闭壳肌5个样本中的组织分布情况和亲嗜性进行检测和分析。病毒阳性信号主要分布于魁蚶外套膜结缔组织中浸润的血细胞和成纤维细胞、肝胰腺和鳃浸润的血细胞、斧足和闭壳肌中坏死肌肉细胞的细胞核中。本研究建立的间接ISPCR检测方法具有灵敏、特异和精确定位的优点，通过组织切片上显示的病毒核酸阳性信号，能判别OsHV-1在不同组织部位的分布特点和受感染的细胞类型；适用于OsHV-1感染的确诊、病毒对不同组织器官的亲嗜性、病毒侵染途径和致病机理等相关研究。

基于长片段PCR扩增的牡蛎疱疹病毒基因组高通量测序 下载：90 浏览：511

史杰1，2 白昌明2 李晨2 蔡生力1 王崇明2 《水产研究进展》 2018年4期

摘要:
为获取2001年低温冻存栉孔扇贝感染牡蛎疱疹病毒(Os HV-1)变异株(ZK2001)基因组序列，并分析ZK2001与其他Os HV-1变异株的序列差异和系统发育关系，利用基于长片段PCR的基因组DNA的扩增和富集技术，获取2001年栉孔扇贝感染Os HV-1变异株的基因组DNA；再使用Illumina Hiseq 2500 PE250高通量测序平台对其测序。最后分析ZK2001与Os HV-1其他变异株基因组的序列差异和系统发育关系。测序数据组装后获得8个Scaffold。基因组变异分析结果显示，ZK2001与参考基因组相比存在328个SNP位点，SNP和序列插入/缺失变异是导致Os HV-1基因组序列变异的主要变异类型。系统发育分析结果显示，ZK2001变异株与分离自我国的Os HV-1变异株亲缘关系最近，与分离自欧洲的Os HV-1μvar及其相关变异株的亲缘关系最远，说明中国和欧洲分布Os HV-1间存在因地理隔离导致的遗传分化。研究表明，基于长片段PCR的DNA富集技术，可以有效地扩增和富集冷冻样本中Os HV-1基因组DNA，并应用于高通量测序。Os HV-1不同变异株基因组序列数据的获取和积累，将为其基因组尺度的基因变异、株系演化和系统发育关系等研究提供重要基础。
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