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瞬时外向钾通道Kv4.3真核表达载体的构建 下载：72 浏览：478

卜超志 周涛 江世文 《生物技术研究》 2020年7期

摘要:
构建Kv4.3真核表达载体,观察其在真核细胞中表达情况。[方法]提取小鼠前额叶皮质RNA,通过RT-PCR和常规PCR技术扩增获得Kv4.3目的基因,利用EcoRⅠ和XbaⅠ限制性内切酶和T4 DNA连接酶将其克隆在pcDNA3.1载体中,并将构建好的重组质粒转染至HEK293细胞中,免疫印迹方法检测Kv4.3蛋白表达。[结果]成功扩增了Kv4.3基因(2 000 bp处有明显条带),先后经酶切和酶连后的重组体转化培养,提取质粒,再通过双酶切观察到2 000 bp处有Kv4.3目的条带和5 400 bp处有pcDNA3.1载体条带。将此重组质粒送去测序,结果显示基因测序结果与GenBank中Kv4.3序列一致。免疫印迹结果发现在HEK293细胞中,转染的重组质粒能够表达Kv4.3蛋白。[结论]成功构建了Kv4.3真核表达载体,其在HEK293细胞中可以稳定表达。

CRISPR/Cas9编辑雪兔Corin基因载体的构建 下载：75 浏览：482

王海禄 李杰 尹俊 《生物技术研究》 2019年6期

摘要:
通过CRISPR/Cas9系统构建雪兔Corin基因编辑载体。[方法]通过在线CRISPR设计工具设计2个靶点,退火制备sgRNA双链,用BbsⅠ酶得到线性p X330载体后,经重组酶连接得到重组质粒。将重组质粒转化到DH5α感受态细胞,再对其进行PCR鉴定及测序比对分析。[结果]通过特异性扩增以及测序结果表明sgRNA准确地连入载体,插入序列无突变,与预期序列高度一致,重组子阳性率为100%。[结论]成功构建了雪兔Corin基因敲除载体,为进一步利用CRISPR/Cas9技术进行雪兔Corin基因编辑工作提供了研究基础。

以SIM卡为载体构建数字身份认证体系的研究与实践 下载：37 浏览：405

常远1 吕晶1 仇剑书2 《信息通信与技术》 2019年12期

摘要:
随着数字时代的到来，网络空间的身份认证需求日益增长，建立良好的数字身份体系，在保护个人隐私和数据的前提下实现网络空间的身份认证成为世界性研究课题。文章通过对国内外著名网络空间数据泄露案例的研究，提出以SIM卡为载体构建数字身份技术体系，并依托公安部正在推进实施的"互联网+"可信身份认证平台，充分利用手机智能终端的便捷性和普及性，在保护个人隐私和数据安全的前提下，实现网络空间的身份认证。

绒毛白蜡FvNCED3基因植物表达载体构建及功能分析 下载：92 浏览：501

王德康 李田 孙景宽 张想军 章秀秀 《生物技术研究》 2018年4期

摘要:
构建绒毛白蜡FvNCED3基因的植物过表达载体并对其基因功能进行分析。[方法]采用双酶切法将绒毛白蜡FvNCED3基因插入pROKⅡ载体中,构建pROKⅡ-FvNCED3植物表达载体;浸花法转化拟南芥,抗性种子经Kan筛选后进行PCR检测;测定不同盐浓度培养基中转基因幼苗和对照植株的鲜重与根长,鉴定其基因功能。[结果]双酶切重组质粒得到1 823 bp的目的片段,表明成功构建pROKⅡ-FvNCED3植物表达载体;转基因种子经50mg/L Kan筛选培养6 d时效果最好,转化率达4.97‰。耐盐性分析表明,盐胁迫下,转基因株系根长显著长于对照,且盐浓度为100 mmol/L、150 mmol/L时,其鲜重分别为对照的1.43倍、2.06倍。[结论]成功构建pROKⅡ-FvNCED3植物表达载体,经PCR证明FvNCED3基因整合到植物基因组中。转基因后代的耐盐性分析初步表明FvNCED3基因具有增强植物耐盐性的功能。

FBXO47 3'-UTR双荧光素酶报告载体构建及与miR-33b-5p靶向验证 下载：94 浏览：516

杨晓燕1,2 谢聃1 赵倩3 尹华丽3 雷小勇2,4 甘润良2,3 《生物技术研究》 2018年4期

摘要:
构建FBXO47基因3'-UTR双荧光素酶报告载体,并验证miR-33b-5p与FBXO47的靶向关系。[方法]采用生物信息学软件预测miR-33b-5p与FBXO47结合位点;利用PCR扩增FBXO47基因3'-UTR序列,将其克隆到GV272载体中,构建FBXO47野生型及突变型双荧光素酶报告质粒;将miR-33b-5p或阴性对照分别与野生型GV272-FBXO47-wt 3'-UTR或突变型GV272-FBXO47-mut 3'-UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。[结果]酶切及测序结果表明,野生型GV272-FBXO47-wt 3'-UTR及突变型GV272-FBXO47-mut 3'-UTR双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性结果表明,相较于对照组,miR-33b-5p可使野生型GV272-FBXO47-wt 3'-UTR的荧光素酶活性降低66%左右;而定点突变GV272-FBXO47-mut 3'-UTR的荧光素酶荧光素酶活性没有显著变化。[结论]成功构建了FBXO47基因3'-UTR的荧光素酶报告基因载体,miR-33b-5p与FBXO47存在靶向性。

EV71抗原双元植物表达载体构建及生菜瞬时表达 下载：88 浏览：504

罗雯 艾佐佐 刘艳梅 刘旺喜 《生物技术研究》 2018年3期

摘要:
构建EV71 P1和3CD基因的双元植物表达载体,通过农杆菌注射渗透法实现在生菜叶片中的瞬时共表达。[方法]根据Gen Bank序列,设计合成EV71 C4亚型P1和3CD基因,分步克隆入植物表达载体p CAMBIA2301,并转化农杆菌LBA4404。农杆菌注射渗透法对意大利生菜叶片进行遗传转化,固相酶联斑点实验和免疫印迹实验检测感染叶片总蛋白提取物,分析外源基因表达效果。[结果]限制酶切验证获得共表达植物表达载体p CAMBIA2301-P1-3CD。感染叶片的外源基因表达产物中具有抗VP1抗体结合活性的蛋白,其分子量约39 k Da。[结论]成功构建EV71 3CD和P1基因双元植物表达载体,其在意大利生菜叶片中的表达产物具有免疫反应性。为利用植物生物反应器生产抗EV71口服疫苗提供了理论和实验依据。
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