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细胞周期因子Geminin对CRISPR/Cas9编辑效率的影响 下载：64 浏览：471

邹文涛 冯娟 吴方 《生物技术研究》 2020年5期

摘要:
旨在探究细胞周期因子Geminin对Cas9在细胞基因组中的编辑效率是否有影响。[方法]将Geminin的前40个氨基酸序列对应的cDNA序列克隆到含靶向COSMC基因的sgRNA的pX459质粒pX459-COSMC-Cas9(wtCas9)上得到能在Cas9蛋白N端融合表达Geminin片段的pX459-COSMC-Geminin-Cas9质粒(Geminin-Cas9)。在人胚胎肾细胞HEK293T或人结肠癌细胞HT29细胞中同时表达wtCas9和Geminin-Cas9蛋白质,检测并比较细胞中Cas9的表达水平和Cas9编辑COSMC基因的效率。[结果]Western Blotting检测发现相比wtCas9质粒,转染Geminin-Cas9质粒的细胞中Cas9表达水平更低,Geminin-Cas9载体对COSMC基因的编辑效率在编辑前期也相对较低,但随着编辑时间的延长,两者的编辑效率趋于一致。[结论]细胞周期因子Geminin的存在能降低Cas9在细胞中的总体表达水平,在编辑前期会在一定程度上降低Cas9的编辑效率,而延长编辑时间又能消除这一影响。

dCas9-gRNA在卡介苗侵染小鼠巨噬细胞过程中对rab7的调控作用 下载：71 浏览：482

郭越 杨文淇 关松磊 《生物技术研究》 2020年3期

摘要:
分析rab7及其下游相关分子rilp和rep1在卡介苗侵袭巨噬细胞过程中的作用。[方法]利用CRISPRERA在线设计鼠源rab7-gRNA序列,构建dCas9调控质粒,比较调控前后rab7、rilp和rep1的mRNA表达量。[结果]成功设计3条rab7-gRNA,构建重组调控质粒p X330S-2-d Cas9-gRNA-T2A-EGFP; BCG感染后,巨噬细胞内rab7及其下游的rilp和rep1的mRNA水平明显上升(P <0. 01); gRNA1调控后,rab7及下游rilp的mRNA水平明显下降(P <0. 05; P <0. 01); gRNA3调控后,rab7及rilp mRNA水平有所下降,但无统计学意义(P> 0. 05)。gRNA1和gRNA3调控对rep1 mRNA水平无明显影响(P> 0. 05)。[结论]在BCG侵染巨噬细胞过程中,rab7作为晚期吞噬体的标志受到dCas9调控后变化明显,rilp作为rab7的下游效应分子,表达水平与rab7的变化一致,而rep1未见明显变化。三者在MTB寄生过程中的作用还有待深入研究。

脂质体介导基因编辑载体质粒转染条件的优化 下载：81 浏览：495

白圣凯1 野庆松1 张芳婷2 盖厦梦1 李文娜1 张青峰1 高书颖1 《生物技术研究》 2019年8期

摘要:
探讨脂质体介导基因编辑载体质粒转染人食管癌Eca-109细胞的最佳条件。[方法]以基于Cre/Lox P系统的p GT-A1B1和基于CRISPR/Cas9系统的p X458-sgRNA8两种基因编辑载体质粒为实验材料,将环状和线性质粒以不同DNA用量(0. 2、0. 4、0. 6和0. 8μg)和不同DNA与脂质体比例(1∶1、1∶1. 5、1∶2、1∶2. 5和1∶3)转染Eca-109细胞,计算转染效率。[结果]不同DNA用量条件下,p GT-A1B1在0. 4μg和0. 6μg时转染效率较高,p X458-sgRNA8在0. 6μg时转染效率较高,与其它DNA用量比较均有显著性差异(P <0. 05)。不同DNA与脂质体比例条件下,p GT-A1B1在比例为1∶1. 5和1∶2时转染效率较高,p X458-sgRNA8在比例为1∶2. 5时转染效率较高,与其它比例比较均有显著性差异(P <0. 05)。同一种质粒的环状和线性结构形态,在DNA用量或DNA与脂质体比例相同时,转染效率差异不显著(P> 0. 05)。[结论]建立了脂质体介导基因编辑载体质粒转染Eca-109细胞的最佳转染条件,质粒p GT-A1B1和p X458-sgRNA8的DNA用量分别为0. 4～0. 6μg和0. 6μg,DNA与脂质体比例分别为1∶1. 5～1∶2和1∶2. 5。

浅谈基因编辑技术在农作物领域中的应用与问题探究 下载：85 浏览：474

邹丹丹 《农业研究进展》 2019年5期

摘要:
随着ZFN、CPISPR/Cas9等基因编辑技术的发展和运用,大量基因编辑作物生产出来,这种背景下,基因编辑作物的检测及安全成为重点研究问题。本文主要围绕基因编辑技术在农作物领域的应用、针对基因编辑农作物的安全评价监管、基因编辑农作物的检测等方面展开讨论,具体分析了基因编辑技术在农业领域的应用现状,并以保障农作物食用安全为主,加强基因编辑作物有关问题的研究,促进农业领域良好发展。

黄颡鱼GnRHR基因的克隆和表达及CRISPR/Cas9构建GnRHR基因敲除突变体 下载：65 浏览：362

李石竹1 方文宇1 骆明飞2 卢建国1 《中国水产学报》 2021年4期

摘要:
为研究促性腺激素释放激素受体(gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR)对黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco性别分化和性腺发育的调控作用,采用逆转录PCR、氨基酸序列多重比对、系统进化树分析及实时定量PCR方法,对黄颡鱼GnRHR基因的序列、表达和进化进行了研究。结果表明:扩增到的黄颡鱼GnRHR cDNA序列长2894bp,包含239bp的5′非翻译区,1155bp的开放阅读框和1500bp的3′非翻译区,预测编码384个氨基酸、7次跨膜结构域蛋白;氨基酸序列多重比对显示,黄颡鱼GnRHR与硬骨鱼类GnRHR的同源性较高,其与斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus、斑马鱼Danio rerio、鲤Cyprinus carpio、银鲫Carassius auratus GnRHR氨基酸序列的一致性分别为96%、87%、83%和82%,与哺乳动物的一致性较低,为42%～44%;系统进化分析显示,黄颡鱼GnRHR与鲤、虹鳟等硬骨鱼类的GnRHR聚为GnRHRⅡB分支;实时定量PCR显示,黄颡鱼GnRHR mRNA主要在端脑、中脑、下丘脑、垂体和精巢中高表达,但在卵巢和其他组织中几乎不表达;通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建和筛选出了黄颡鱼GnRHR突变体,成功获得了各种不同的黄颡鱼GnRHR F0代突变体。研究表明,GnRHR可能参与调控黄颡鱼雄性发育,黄颡鱼GnRHR F0代突变体的获取为探索GnRHR的功能和机制提供了基础资料。
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