文章-世纪中文出版社

潘传燕1 冯鹏霏1 林勇1 罗洪林1张永德1 苏乾莲2 《生物技术研究》 2019年3期

摘要:

构建尼罗罗非鱼ZAP-70原核表达载体,纯化其重组蛋白并制备多克隆抗体。[方法]采用无缝克隆技术构建尼罗罗非鱼ZAP-70重组表达载体,并转入大肠杆菌B21中诱导表达,将表达的ZAP-70蛋白免疫日本大耳兔得到多克隆抗体,采用Western Blotting和ELISA技术鉴定抗体的特异性和效价。[结果]成功构建原核表达重组质粒p ET-B2m-ZAP-70,诱导表达的重组蛋白分子量约为39 k Da,主要以包涵体的形式表达;获得效价为1∶512 000的多克隆抗血清,WB检测显示该抗体能够特异性的识别所表达的ZAP-70重组蛋白。[结论]尼罗罗非鱼ZAP-70重组质粒在大肠杆菌B21中高效表达,分子量约为39 k Da,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步探索ZAP-70在尼罗罗非鱼免疫系统中的功能奠定了基础。

尼罗罗非鱼跨膜Bax抑制剂母体6基因Tmbim 6的克隆、表达及功能鉴定下载：53 浏览：290

巫祎琴陈福暖张志强江栢坚简纪常黄瑜《中国水产学报》 2023年3期

摘要:

为了解跨膜Bax抑制剂母体6(transmembrane Bax inhibitor motif containing 6, TMBIM 6)在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)病原体感染中的作用，利用聚合酶链式反应(PCR)对Tmbim 6基因进行克隆与鉴定，并采用实时荧光定量PCR(qPCR)分析Tmbim 6在健康尼罗罗非鱼(体质量为80～100g)的组织分布模式及无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、Poly I:C模拟病毒刺激后的表达变化。结果表明：尼罗罗非鱼Tmbim 6开放阅读框为714bp,可编码237个氨基酸，包含6个跨膜结构域和1个C-末端基序；亚细胞定位显示，尼罗罗非鱼TMBIM 6定位于细胞质，双荧光素酶报告基因系统检测发现，Tmbim 6在HEK-293T细胞中过表达后极显著抑制NF-κB通路(P<0.01);qPCR分析显示，Tmbim 6基因在所检测的组织中广泛分布，在肝脏和肌肉中的表达量最高；经无乳链球菌感染和Poly I:C刺激后，Tmbim 6在肝脏、脾脏、头肾、脑和肠道中的表达水平均显著上调(P<0.05)。研究表明，尼罗罗非鱼TMBIM 6参与了无乳链球菌感染和Poly I:C刺激后的细胞应激过程及免疫反应。

尼罗罗非鱼高迁移率族蛋白4(TOX4)基因克隆及其在细菌感染过程中的表达特征下载：51 浏览：284

江栢坚1,2 张志强1,2 巫祎琴1,2 于劼豪1,2 黄瑜1,2 简纪常1,2 《中国水产学报》 2023年1期

摘要:

为了解析与胸腺细胞选择相关的高迁移率族蛋白4(tox high mobility group box family member 4,TOX4)在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)响应无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染过程中的功能，利用聚合酶链式反应(PCR)克隆和鉴定尼罗罗非鱼TOX4基因(GenBank登录号：XP003458812)的开放阅读框(open reading frame, ORF)序列，对推导的TOX4氨基酸序列进行生物信息学分析，分析其亚细胞定位特征，以及在尼罗罗非鱼头肾淋巴细胞亚群的分布特征，并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析TOX4基因在健康鱼各组织及响应无乳链球菌感染过程中的表达模式。结果表明：尼罗罗非鱼TOX4基因的ORF全长为2 004bp,编码667个氨基酸，预测TOX4蛋白的相对分子质量为69 060,理论等电点为4.69,无信号肽序列及跨膜结构，具有一个HMG保守结构域；亚细胞定位结果显示，TOX4蛋白主要表达于细胞核中；多序列比对及系统进化分析均显示，尼罗罗非鱼与斑马拟丽鱼(Maylandia zebra) TOX4氨基酸序列的同源性最高；qRT-PCR分析显示，TOX4基因在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达，且在血液中表达量最高；单细胞转录组数据分析显示，TOX4基因主要在尼罗罗非鱼非特异性细胞毒性细胞(nonspecific cytotoxic cell, NCC)和巨噬细胞(macrophage, Mφ)中表达；经无乳链球菌感染后，尼罗罗非鱼脑、头肾、肠道和脾脏中TOX4基因的表达量显著上调，并在感染后12h(脑、头肾、肠道)和48h(脾脏)达到峰值。研究表明，TOX4可能参与尼罗罗非鱼响应细菌感染的免疫应答过程。

尼罗罗非鱼清道夫受体基因Scara3的克隆及病原微生物刺激后的表达响应下载：43 浏览：344

胡惠玲1,2 汪志文1,2 黎源1,2 鲁义善1,2 简纪常1 《中国水产学报》 2022年2期

摘要:

为探究清道夫受体3(scavenger receptor class a member 3,Scara3)在尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus抵御病原微生物过程中的作用，采用聚合酶链式反应克隆得到罗非鱼Scara3基因，利用荧光定量PCR技术分析Scara3在健康尼罗罗非鱼组织分布及细菌、病毒感染后的表达情况，并进行亚细胞定位分析。结果表明：克隆得到尼罗罗非鱼Scara3基因cDNA全长序列为3 889bp,开放阅读框(ORF)为1 827bp,编码608个氨基酸，具有跨膜结构域和胶原(Collagen)结构域；多序列比对发现，Scara3氨基酸序列在脊椎动物中相对保守；亚细胞定位显示，Scara3蛋白在全细胞分布；荧光定量PCR分析显示，Scara3基因在健康罗非鱼各组织中均有表达，在血液、肠道、皮肤和胸腺等组织中表达量较高且显著高于其他组织(P<0.05);经脂多糖(LPS)、灭活无乳链球菌Streptococcus agalactiae和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激罗非鱼头肾白细胞后，Scara3表达量显著上调(P<0.05),经灭活无乳链球菌和Poly I:C刺激后，肠道、头肾和皮肤组织中的基因表达量表现出时序性。研究表明，尼罗罗非鱼在对细菌和病毒感染的免疫反应活动中，Scara3基因起着重要作用，本研究结果为后期硬骨鱼类中Scara3基因的功能研究提供了科学参考。

低温胁迫下鱼类鳃中RPL11/MDM2/P53信号通路相关基因及蛋白表达差异分析下载：64 浏览：398

刘明丽1,2,3 杨文意1,2,3 王金凤1,2,3 陈良标1,2,3 《中国水产学报》 2021年2期

摘要:

为了研究RPL11/MDM2/P53信号通路在鱼类低温胁迫中所起的作用,分别利用mRNA和蛋白表达水平定量技术,对罗非鱼Oreochromis niloticus和斑马鱼Danio rerio两种抗寒能力不同的鱼类鳃RPL11/MDM2/P53信号通路相关因子在低温胁迫下的表达情况进行分析。结果表明:在相同低温胁迫下,罗非鱼鳃中RPL11和P53蛋白表现出随着低温胁迫时间延长而增加的趋势,但斑马鱼鳃中P53蛋白开始增加的时间点晚于罗非鱼;罗非鱼鳃中mdm2转录表达量在8℃、6 h后显著升高(P<0.05),表明mdm2表达量升高可能活化P53;8℃、6 h后P53下游靶基因bad和p21在罗非鱼鳃中出现表达量升高的情况,这与罗非鱼中6 h时P53蛋白表达量升高是一致的,但在斑马鱼中p21基因表达量变化不大。研究表明,低温能诱导罗非鱼中与凋亡相关的RPL11/MDM2/P53通路中相关蛋白的变化,并且这种表达变化模式与耐低温能力较强的斑马鱼不同,这种物种差异性的基因表达模式可能是不同鱼类低温耐受能力差异的原因之一。

罗非鱼湖病毒核蛋白的克隆表达、抗体制备及其组织分布下载：73 浏览：500

苏国茂秦真东李嘉波周萌莫金凤张凯梁日深吴灶和赵丽娟林蠡《水产研究进展》 2020年3期

摘要:

近年来罗非鱼湖病毒(TiLV)在多个国家流行，对世界罗非鱼养殖业造成严重威胁。中国是罗非鱼第一养殖大国，尽管我国大陆还没有TiLV的正式报道，鉴于吉富罗非鱼是我国重要的罗非鱼养殖品种，其对TiLV的感染特性研究具有重要意义。本实验采用TiLV对吉富罗非鱼进行人工感染，随后在肝脏组织中克隆和测定了TiLV第6片段基因。罗非鱼湖病毒第6片段基因cDNA全长1 044 bp，开放读码框(ORF)为954 bp，编码317个氨基酸，预测分子量为36.38 ku；5′非编码区(NCR)为19 bp，3′非编码区(NCR)为972 bp。系统进化树分析表明该蛋白属于TiLV核蛋白(NP)。随后在大肠杆菌中表达和提纯了GST融合NP蛋白，在新西兰大白兔上制备了多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价为1∶51 200，且抗体可特异性识别感染组织中的病毒NP蛋白。对吉富罗非鱼不同组织进行苏木精—伊红(H.E)染色观察，发现肝脏组织坏死并形成合胞体，脾脏部分细胞出现空泡、坏死，含铁血黄素增多，头肾细胞坏死，鳃丝上皮细胞明显解离脱落，鳃小片黏连，脑组织细胞肿大。通过蛋白印迹法(WB)和免疫组化(IHC)对人工感染TiLV的吉富罗非鱼不同组织进行检测，结果显示，NP蛋白在肝脏、脑、体肾和头肾等组织中均有表达，以肝脏组织中表达量最高。为了解吉富罗非鱼对TiLV的免疫反应，通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)测定免疫因子TNF-α和TGF-β在主要免疫器官脾脏和头肾组织中的表达。研究表明，在感染早期(感染后12～24 h)，病毒可显著抑制TNF-α和TGF-β在脾脏和头肾中的表达，可能通过抑制宿主这些免疫因子来促进病毒自身早期的复制。本研究将为进一步解读TiLV的致病机理及其高效防控提供理论基础。

尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果下载：88 浏览：499

蔡玉臻1，2 刘志刚1 卢迈新1 可小丽1 高风英1 曹建萌1 《水产研究进展》 2019年5期

摘要:

链球菌病是威胁我国罗非鱼养殖产业健康发展的重要病害之一。为研制出免疫效果好、操作简便的罗非鱼链球菌病疫苗，本研究构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的穿梭质粒pNZ8124-Sip，通过酶切和测序验证后电转化乳酸乳球菌NZ9000，获得能够诱导重组表达无乳链球菌Sip蛋白的乳酸菌活菌载体疫苗。采用SPS-PAGE电泳摸索最佳诱导浓度和诱导时间以获得最大表达量，通过镍柱纯化目的蛋白并进行Western blot检测；利用不同浓度的重组乳酸菌活载体疫苗灌胃口服免疫尼罗罗非鱼，采用间接ELISA法测定免疫后血清抗体水平变化，通过人工腹腔注射感染无乳链球菌获得相对免疫保护率。研究结果显示，构建的重组乳酸乳球菌可通过nisin诱导表达大小为48 ku特异性蛋白，与目的蛋白大小一致；PAGE电泳显示，重组蛋白主要以可溶蛋白和包涵体2种形式存在，其中胞内可溶性蛋白浓度达7.65 mg/mL；诱导表达的最佳条件为100 ng/mL nisin诱导6 h；Western blot检测结果显示，诱导蛋白可与鼠抗His标签抗体特异性结合。口服免疫结果显示，中浓度组(2.24×1010 CFU/mL)和低浓度组（2.24×10～9 CFU/mL）免疫2次能够显著提高尼罗罗非鱼的血清抗体水平和抗无乳链球菌感染能力，中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为41.0%。本研究可为罗非鱼链球菌病口服疫苗的研究奠定基础，具有广阔的应用前景。

温度对马来西亚红罗非鱼越冬期体色的影响下载：85 浏览：522

王兰梅1 宋飞彪2 朱文彬1 董娟娟2 傅建军1 董在杰2 《水产研究进展》 2018年2期

摘要:

为了解马来西亚红罗非鱼体色分化变异的遗传分子机制，以期解决其越冬期的体色变异问题，本研究比较了越冬期不同温度处理(16、20、25和30°C)对其表观体色、酪氨酸酶活性以及皮肤色素带和黑色素细胞的影响。实验50 d后发现，16°C组大部分鱼体较实验开始时变黑，整个鱼体呈现青灰色，20°C组多数鱼体腹部也变为青灰色。随着温度的升高，红罗非鱼背部皮肤、腹部皮肤和血清中酪氨酸酶的活性逐渐升高，25°C时达到最高值，而随着温度的继续升高，30°C组鱼的酪氨酸酶活性反而降低。血液中tyr m RNA的表达量随着温度的升高而升高，25和30°C组红罗非鱼肌肉中的tyr m RNA表达量也显著高于16和20°C组。切片显微结构发现，随着温度的升高，红罗非鱼背部皮肤的黑色素细胞数量减少。研究表明，马来西亚红罗非鱼越冬期的体色变异可能是其皮肤黑色素细胞数量和体内酪氨酸酶活性改变的结果，深入研究其调控机制有助于了解鱼类体色遗传机理并进行体色性状的改良。

罗非鱼大规格养殖技术及发展对策下载：37 浏览：375

叶惠玲《当代畜牧兽医》 2025年2期

摘要:

为了促进罗非鱼养殖技术水平提高、满足罗非鱼大规格养殖需要、促进罗非鱼养殖行业发展；对罗非鱼大规格养殖中几项关键技术进行分析，同时对该行业的发展前景进行阐述，结合当前发展现状提出多项有效的发展对策；罗非鱼养殖行业具有广阔的发展前景，养殖行业整体利润较高，掌握大规格养殖关键技术能够有效提高罗非鱼产量和质量，从而促进罗非鱼养殖行业发展，希望本文所提出的意见和措施能够对罗非鱼养殖行业技术水平提高有所帮助。

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