一.引言
免疫应答机制是指机体受抗原刺激后，免疫细胞对抗原分子识别、活化、增殖和分化，从而产生免疫物质发生特异性免疫效应的过程。免疫系统功能包括免疫防御，免疫监视和免疫自稳。具有防止外界病原体的侵犯，清除已入侵病原体及其他有害物质。人体免疫分为特异性免疫和非特异性免疫，随时发现和革除体内出现的非自身成分，维持免疫系统内环境的稳定，保证免疫功能的正常的进行的功能。一个是后天获得的，另一个为天生具有的功能。一般在病原体刺激淋巴细胞之后会产生抗体。
昆虫因没有特异性免疫的存在，所以先天免疫在昆虫抵御外来生物等入侵中发挥至关重要的作用，那么选择昆虫作为免疫应答机制研究的模式生物，有助于我们研究先天免疫在抵御外界条件影响过程中的作用机制。果蝇的繁殖周期短，它们的粘膜结构和免疫信号与哺乳动物呈现高度的保守性。因此可以从果蝇的研究推及至哺乳动物的肠道免疫机制。当病原微生物侵染果蝇体内时，果蝇会通过在脂肪体内形成抗菌肽，随后分泌到血淋巴中，通过改变病原微生物的细胞膜通透性以此达到杀死病原体的目的。目前果蝇中已发现三十几种编码抗菌肽的基因，抗菌肽是多细胞生物抵御外部侵害的第一道防线，能够及时有效清除细菌、真菌、病毒等的感染。
肠道菌群是一个复杂的微生态系统，数量很多，它可以参与体内维生素，蛋白质，脂肪等和合成和代谢，促进机体免疫。肠道菌群和免疫系统之间的相互作用是广泛而关键的，不仅允许共生细菌和口腔食物抗原的耐受，而且使免疫系统可以识别和攻击细菌，从而防止细菌的入侵和感染。肠道菌群可以直接影响肠道的免疫状态，还可以在多个水平上对先天免疫和获得性免疫有更广泛的作用。
有研究表明利用肠道细菌侵染果蝇的细胞，进行转录组的测序，发现果蝇先天免疫等信号通过大规模上调，但是大肠杆菌所分泌的细胞外多糖在病原与宿主接触前就会被宿主识别，进而促进宿主抗菌肽、细胞自噬等免疫通道。目前已知关于肠道细菌侵染对于果蝇的先天免疫系统的影响有了一些认识，但是对于肠道细菌如何影响免疫的相关机制，目前尚不明确，仍需进一步的探讨研究。
研究果蝇天然免疫常用的革兰氏阴性菌是 Ecc15，其最适培养温度是29℃， 适用于在LB培养基上生长，对利福平具有抗性，如果以系统感染的方法感染果蝇，菌液最适浓度为 OD600=100。Ecc15 感染健康的野生型果蝇后，死亡率很小甚至没有，通常在 5.5 天后通过免疫系统清除感染的细菌。因此我选择将这个Ecc15作为病原体，对果蝇的免疫应答系统进行研究。
二.方法与材料
2.1材料
无菌果蝇，果蝇的食物（由九种材料熬制，所有材料均为食品级），电子天平，锅子，搅拌棒，塑料管，棉花，果蝇食物分装仪器，量杯，LB培养基（由四种材料组成），培养皿，葡萄果汁，大肠杆菌
2.2实验方法
2.2.1果蝇食物的配制
首先在高温状态下依次加入蒸馏水7 L，琼脂74.2 g，酵母225.33 g，蒸馏水500 mL，氯化钙5.082 g，蔗糖221.34 g，葡萄糖403.2 g，玉米粉543.9 g，蒸馏水1500 mL，不断搅拌混合物至沸腾成糊状，然后保温状态加入山梨酸钾14g，尼克净105mL继续搅拌至没有泡沫产生。15分钟后将锅中的食物倒入量杯，600 mL为一次倒入分装仪器，分入事先准备好的塑料管。全部装完之后，在管口塞上棉花，放入冷藏室进行凝固。
2.2.2LB培养基的配制
液体培养基:称取2.0 g Tryptone、2.0 g NaCl、1.0 g Yeast extract，加入超纯水定容至 200 mL，121℃高压灭菌 15 min，冷却后于4℃冷藏备用;固体培养基:称取10.0 g Tryptone, 10.0 g NaCl、5.0 g Yeast extract，15.0 g Agar，加入超纯水定容至1000 mL，121℃高压灭菌15 min，冷却至50-60℃后倒入平板中，每个平板 15-20 mL，待平板冷却凝固后吹干表面水蒸气，于4℃冷藏备用。
2.2.3无菌果蝇的准备
将大量混装的果蝇倒入一个大的塑料罐中，在事先准备好的由葡萄果汁琼脂混合而成的培养皿上涂上黄豆大小的酵母球以吸引果蝇在培养皿上进行产卵，然后将其罩在瓶口，套上固定套，等待两个小时之后，将塑料罐中的果蝇拍至底部，将培养皿拿出盖上盖子，将果蝇重新装好。
把培养皿拿到无菌通风橱，打开通风装置以及明灯，准备好操作需要的无菌纸巾，无菌刷子，镊子，无菌滤网，蒸馏水，75%的酒精溶液，50%的次氯酸钠溶液。
先用无菌镊子夹取一个滤网放入水中，再夹取一个刷子，用刷子将培养皿上的虫卵刷至滤网中，再夹取一张纸，将滤网从水中拿出放置在纸上。再将滤网移至次氯酸钠中三分钟后拿出放在纸上吸水。然后将滤网放入酒精溶液中，分别过滤两次，最后再放入水中过滤两次。用刷子将洗净的无菌虫卵放入事先准备好的食物管中，过两周后就可以形成无菌果蝇。
2.2.4接种并培养感染用细菌
用接种环蘸取-80℃甘油保藏的ECC15菌悬液，在新鲜LB固体平板上划线，30℃恒温培养24 h。挑取平板上单菌落转接至LB液体培养基中，置于30℃恒温摇床中过夜培养。
2.2.5肠道细菌感染
用比色皿装溶液放装溶液放到分光光度计，先将液体取一毫升加入到第一管，再将菌液取1毫升加入到2,3管（ps.管子光面朝侧面），测吸光度，将LB吸光度归零，测得菌液光度值分别为1.522和1.477，用完比色皿后洗净倒置。将菌液放置在离心机中，设置10分钟6000转从负二摄氏度到4摄氏度停止。离心完之后，把水倒掉留下菌，滴入PBS两毫升，用移液枪反复用PBS洗菌液，将液体挤到管子中，把管子放在离心机，然后再次加PBS，用移液枪反复吹打到溶液至均匀，放入离心机，然后换5%蔗糖溶液重复上述操作，最后在管中加入果蝇放置在29度环境。
2.2.6果蝇基因组提取
材料:果蝇，0.5mm的无菌陶瓷研磨珠，溶液:70%乙醉，异丙醇，无菌水，5M醋酸钾溶液，2x溶液A:200mM Tris-HCl（PH8.0)，200mM NaC1，100mM EDTA(PH8.0)，4% SDS
实验步骤:
1）在1.5mL离心管中，装入5只雄果蝇。加入250μL无菌水以及0.5mm的无菌陶瓷研磨珠，用研磨机器high speed研1分钟。加入260uL的2X溶液A并震荡混匀。
注意事项:因溶液A中含有SDS，如果直接加入溶液A进行研磨，会产生大量的泡沫，从而影响研磨效果。如果为红眼果蝇，在研磨前去除头部，红眼色素会影响DNA产物的颜色。
2）加入190μL 5M醋酸钾溶液，震荡混匀，冰浴 15分钟。
3）室温离心13000g，5分钟，收集上清并转移至新的1.5mL离心管。
4）重复step3。
5）加入750μL异丙醇，轻柔地上下颠倒几次，室温孵育 5分钟
6）室温离心13000g，5分钟，去除上清，底部白色沉淀为基因组DNA。
7）加入1mL 70%乙醇，上下颠倒几次，清洗基因组DNA，室温离心13000g，5分钟，去除上清。
8）风干直至基因组DNA呈透明状。
9）用100μL无菌水重悬DNA，并检测浓度，将DNA浓度稀释至100ng/μL。一般开管晾。
10）取200ngDNA作为模板，用rp49 特异性引物进行PRC鉴定。
11）PCR程序为第一步95℃，15min第二步95℃，30s第三步:55℃，30s次;第五步;72℃，30s，第二步至第四步循环25-35次
12）用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定rp49特异性片段
表1.凝胶电泳体系构成
制作一个琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.3g以及1*TAE 30mL ,倒入模版。凝固后，将其放入电泳池，在模版空中竖直逐滴加入PCR溶液8μL，插入电极。过一段时间，放入凝胶分析器得出图像。
2.2.7无菌/感染果蝇细菌检测
1）准备：
（1）倒板：将提前准备好的琼脂液加热，放在无菌环境，先将封口滤纸在酒精上烤，再烤瓶口，单手打开培养皿，将琼脂液倒入，摇匀，大致4mm高，倒扣凝固。
（2）将提前准备好的无菌果蝇从冷藏箱中拿出，挑选其中30只雄蝇。
（3）将提前在果蝇食物中放入细菌的果蝇拿出（已挑选过雄蝇）
2）实验：
先拿出10个ep管，放在凹槽里，写上标签，(蔗糖从10的0次到10的4次，菌液也是)将果蝇10只放入ep管中，加入bead，加200μL的LB，，加入十只果蝇，用漩涡混合器摇匀，放在冰块里进行冷藏，再在另外三根ep管中加入180μL的LB，用移液枪将蔗糖的10的0次吸取20VL到蔗糖10的1次，依次操作，菌液的同上，每一步之间都要摇匀。接下来分别取蔗糖的100、菌液的102、103、104倍稀释液涂平板，分别取对应溶液200μL逐滴滴入平板20滴左右，将玻璃推棒放在酒精灯上杀菌，冷却后烤一下盖子放在一边，上下推推棒，并转平板，至均匀，烧一下盖子，盖上。用火烤推棒冷却，放回酒精中。放在29℃冷藏保存。
三. 实验结果
3.1果蝇的基因提取结果
根据图1紫外光谱扫描结果所示，溶液在260nm处存在特征吸收峰，与DNA的特征吸收波长一致，说明本次实验成功提取到了果蝇的基因组DNA。同时根据溶液A260/A280和A260/A230测定结果，说明本次实验所提取到的DNA纯度相对较高，溶液中所含有的蛋白质、RNA等杂质较少。同时检测结果显示，本次所提取的DNA的浓度为485.2 ng/ul，DNA的浓度相对较高。检测DNA浓度可以提供溶液中DNA含量信息，为后续的PCR扩增实验提供基础数据，从而确定合适的扩增循环次数。
因实验时间所限，本次实验PCR扩增实验选择的引物为果蝇的基因引物rp49，其信息如下：
Forward: 5’ AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3’；
Reverse: 5’CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3’。
有研究表明，果蝇肠道微生物参与了果蝇的免疫应答反应，可以帮助果蝇更好地抵抗外界因素的干扰。后续实验中我们可以设计合适的引物片段，对果蝇肠道微生物基因进行扩增，从而灵敏地检测到共生菌相关免疫基因的表达情况，有助于研究肠道内环境以及果蝇的免疫应答机制。
3.2果蝇对于ECC15的免疫应答机制结果
果蝇肠道微生物平板涂布结果如图2所示。根据实验过程中各试剂的用量进行计算，结果为实验组的细菌数大致为19个/μL，对照组的细菌数大致为70个/μL。实验组的细菌数远大于对照组，但对照组也有一些形态不一样的细菌，对照组肠道内的菌群参与了免疫应答，因此提高了宿主的免疫力。平板涂布实验可以经过分离纯化得到单一的细菌菌落，并通过控制单一变量实验，从而研究不同肠道微生物对果蝇免疫应答机制的影响。
图2.平板计数结果
四. 结论与讨论
果蝇先天免疫等信号通过大规模上调。本文主要研究了果蝇对于Ecc15菌的免疫应答机制，以果蝇作为模式动物做了以上实验，使用了对照实验法，收集到 Ecc15菌对果蝇的肠道菌群有破坏作用，但不到致死的地步，因而得出果蝇对于Ecc15菌侵染具有免疫应答。在本实验中也会遇到如菌液没有抹匀，导致侵染数据无法计算的情况。
果蝇与人体具有高度的保守性，是重要的人类疾病研究模型，在人类的肠道菌群研究中起到基础性作用，为精准医疗提供基础科研成果，如今在医学与生物学对人体研究越来越深入的情况下，人类与人类体内菌群共存问题开始变得更加重要，肠道作为人类进食消化的重要器官，其功能与内部菌群也互相影响，发挥出重要作用，希望可以通过果蝇实验探究出人体肠道对于细菌的免疫应答机制的原理，实现人类与菌群的和谐共生，解决菌群可能给人类带来的疾病。
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