临床行病原微生物检验的方法为细菌培养、细菌表型鉴定等，检验过程中需通过细菌产气、产酸、生长代谢等存在的差异实施选择性培养，通过不同细菌生理及生化指标存在的差异完成鉴定[1]。上述方法操作相对复杂，检验耗时较长，如致病菌培养难度过大、患者近期服用抗生素、病原微生物中存在干扰性物质，则可导致病原微生物阳性检出率显著降低，进而影响患者疾病的治疗。伴随科技的发展，分子生物学技术逐步成熟完善，PCR（聚合酶链式反应）、核酸杂交、生物传感技术等分子生物学检验技术在病原微生物检验中得到日益广泛的应用，此类技术均以核酸为基础，具有高敏感性及检验时间短等优势[2]。为深入分析病原微生物检验的最佳方法，本研究抽取院内病原微生物样本，探究分子生物学技术的应用价值。
资料与方法
1.1一般资料
研究年限区间为2021年2月-2022年2月，择取样本为85例行病原微生物检验患者，男42例，女43例，年龄范围为28-66岁，平均（47.55±2.91）岁，全部患者均知晓研究内容，签署研究知情同意书。
1.2方法
全部患者均行常规RT-PCR检验、实时荧光RT-PCR检验，采集病原微生物样本，医师依据试剂盒说明书规范完成样本检验。
1.3评价标准
统计对比常规RT-PCR检验阳性检出率、实时荧光RT-PCR检验阳性检出率。
1.4统计学方法
采用SPSS23.0软件计算各类数据，计量资料为（x±s），检验方法为t，计数资料为（%），检验方法为χ2，如P＜0.05，则组间有差异。
2结果
常规RT-PCR检验阳性检出率为（48/85）56.5%，实时荧光RT-PCR检验阳性检出率为（69/85）81.2%，实时荧光RT-PCR检验显著高于常规RT-PCR阳性检出率（P＜0.05）。
表1对比常规RT-PCR检验、实时荧光RT-PCR检验阳性检出率（n/%）
3讨论
3.1分子生物学技术概述
伴随科技的发展进步，生命科学及化学领域的研究不断深入，人们对于生物体的认知已从单一生物质过渡至组织器官、细胞结构、核酸、蛋白质等分子水平。分子生物学技术可通过对核酸序列等分子水平线性结构的检测对比不同个体的差异，进而提升病原微生物阳性检出率[3]。目前，分子生物学检验技术在遗传学、医学、生物学等领域均取得良好的应用效果，并带动现代医学由细胞水平朝向基因水平、分子水平方向发展，通过PCR等分子生物学技术对微生物生物学特性、致病性、药物耐受性的分析，可为多种疾病的防治提供有价值的参考信息。
3.2 PCR技术在病原微生物检验中的价值分析
本研究采用的PCR技术为临床行病原微生物检验广泛应用的分子生物学技术，该技术可完成特定DNA片段的放大及扩增，进而实现体外特殊类型DNA的有效复制，使微量DNA水平大幅度增加[4]。PCR技术与天然DNA复制过程近似，检验过程中需将模板DNA加热至93℃，维持该温度一定时间后，PCR扩增后形成的双链DNA处于解离状态，进而形成单链DNA，引物可结合单链DNA，进而完成后续反应。模板DNA温度降低至55℃后，其单链的互补序列可结合引物，通过DNA聚合酶的作用可依据碱基互补配对的基本原则形成全新的半保留复制链[5]。重复进行变性、退火、延伸等环节，可获取多个半保留复制链，进而实现对DNA的放大及扩增。
PCR反应具有较高的灵敏度及特异性，PCR扩增反应的总时长约为2-4h，且无需培养细胞或分离病毒、细菌，可将RNA或DNA粗制品作为扩增模板，进而高效、精确的完成活组织、细胞、体腔液、血液、洗漱液、毛发等样本的DNA扩增检验。PCR技术在病原微生物检验中的价值如下，（1）呼吸道感染病原微生物检验：呼吸道感染为临床常见疾病，病原微生物主要包括病毒、细菌、支原体、衣原体、寄生原虫、放线菌等。常规细菌培养检验技术需数周方可获取检验结果，极易导致患者病情延误。研究人员采用实时荧光PCR技术，通过引物与DNA聚合酶的反应，2.5h便可检出嗜肺军团菌等病原微生物，通过对症治疗干预，患者病情得到有效控制[6]。（2）感染性疾病快速诊断：PCR技术可准确测定原虫、霉菌及多种细菌、病毒的靶DNA，具有较高的特异性及敏感性，检验过程中自动化程度较高，可显著提高阳性检出率，为感染性疾病的治疗提供参考。（3）肠道病毒感染：临床检验肠道病毒的常规方案为血清中和试验，依据试验结果可将肠道病毒划分为脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、艾可病毒等[7]。部分肠道病毒培养难度较大，通过血清中和试验无法准确分型，进而影响临床治疗。将分子基因技术与PCR技术相结合，可有效解决血清中和试验对部分病毒无法分型的问题，有助于提高多种肠道疾病的治疗效果，预防肠道疾病相关并发症。
3.3本研究数据资料相关分析
本研究结果显示，常规RT-PCR检验阳性检出率为（48/85）56.5%，实时荧光RT-PCR检验阳性检出率为（69/85）81.2%，实时荧光RT-PCR检验显著高于常规RT-PCR阳性检出率，提示病原微生物检验中应用分子生物学技术价值突出，采用实时荧光RT-PCR检验可提高阳性检出率。分析其原因，PCR技术属于体外酶促DNA片段合成的分子生物学技术，检验过程主要包括变性、退火、延伸等环节，反应过程与天然DNA复制近似，变性期间需在93℃左右的条件下解离双链DNA，使其形成单链DNA。退火过程需在适宜温度条件下使单链DNA模板与引物结合，延伸过程则需将dNTP作为底物，利用DNA聚合酶作用，依据碱基互补配对的基本原则形成全新的模板DNA链。与常规病原微生物检验技术相比，PCR技术的主要优势为灵敏度及特异度较高，最小细菌检出率进而达3个细菌，检验的灵敏度可达3个RFU，并可实现多种病原微生物的分线鉴别诊断。PCR技术操作简单，检验耗时约为2-3h，可及时获取检验结果，避免患者病情延误。常规PCR检验无法区分部分病原微生物，实时荧光RT-PCR主要特点为在PCR体系内部加入荧光，通过荧光信号的积累及标准曲线的定量分析，可实现对未知模板的有效分析，进而提高病原微生物阳性检出率，其应用价值优于常规RT-PCR[8]。
3.4其他分子生物学技术在病原微生物检验中的价值分析
核酸杂交技术是近年来广泛应用的分子生物学技术，该技术主要包括分子DNA放大信号、Northem杂交、原位杂交等，此类技术以复性动力学为基本原理，检验过程中需使用RNA探针或DNA探针，该技术具有较高的敏感性与特异性，操作简便，诊断耗时较短，可实现对多种病原微生物的准确检验[9]。原位杂交是较为成熟的核酸杂交技术，该技术主要特点是将对已知序列核酸实施标记，将其作为探针，并与组织切片或细胞中的核酸实施杂交，进而实现特定核酸定位与定量检验。部分研究人员对原位杂交技术进行改良，采用荧光素标记寡核苷酸探针，使其成为FISH技术，该技术可实现多重染色，杂交特性较高，检测信号强度较大，通过显微镜观察可见病原微生物的空间位置，进而实现对细菌的快速检测。
伴随生物传感器等先进技术的发展，电化学检验技术应用范围逐步扩大，此类技术的主要特点为检验成本低廉，阳性检出率较高。电化学检验技术的基本原理是利用核苷酸探针电极与靶核酸实施杂交，完成杂交后电子装置可显示检验结果。焦磷酸测序技术为全新的病原微生物检验技术，该技术利用生物发光完成DNA序列的综合分析，检验过程中需利用荧光素酶、DNA聚合酶、双磷酸酶等物质测定荧光释放情况，进而获取所需的检验结果。焦磷酸测序技术可实时、迅速完成病原微生物的检验，并可对病原微生物进行分类，进而为临床治疗提供参考。分子生物学技术在病原微生物检验中具有突出优势，但部分技术尚未得到广泛应用，在实际检验过程中仍存在一定缺陷，医疗机构需深入研究各类分子生物学技术的特点，结合自身实际情况合理选用，以提高相关技术的实际应用效果[10]。
综上分析可知，病原微生物检验中应用分子生物学技术价值突出，采用实时荧光RT-PCR检验可提高阳性检出率，值得全面推广应用。同时，本研究中抽选病例样本量较少，研究环节存在不足，研究总时间较短，缺乏同类型数据资料横向对比研究分析，病原微生物检验中应用分子生物学技术的机制仍需深入探讨。
参考文献
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[4]刘元江.分子生物学技术在病原微生物检验中的应用探讨[J].临床检验杂志（电子版）,2020,9(3):372-373.
[5]BruchRomanr.bruch@hs-mannheim.de1RudolfRüdiger1MikutRalf2ReischlMarkus21Institute of Molecular and Cell Biology,Faculty of Biotechnology,Mannheim University of Applied Sciences,Mannheim,Germany2Institute for Automation and Applied Informatics,Karlsruhe Institute of Technology,Karlsruhe,Germany.Evaluation of semi-supervised learning using sparse labeling to segment cell nuclei[J].Current Directions in Biomedical Engineering,2020,6(3):398-401.
[6]王俊芳.病原微生物检验中分子生物学技术的应用效果分析[J].医药前沿,2020,10(18):96-97.
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[8]李玲,杨丽玮.病原微生物检验中分子生物学技术的应用效果分析[J].临床检验杂志（电子版）,2019,8(3):173.
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[10]马明立.分子生物学技术在病原微生物检验价值[J].中国保健营养,2021,31(9):335.
