前言
流式细胞仪是集流体学、光学和电子学为一体的细胞或颗粒分析仪器。随着光纤光学的发展与成熟，光纤作为光路引导元件应用到流式细胞仪中，可以使流式细胞仪采集来自多个激光器激发的荧光素全光谱信号，分辩单细胞上的多种荧光标记，显著提高了高参数细胞分析的灵敏度，极好的解决了流式检测受技术局限的问题。
本文从流式细胞仪的原理出发，讨论石英多模光纤作为光路引导元件在流式细胞仪中的作用机制，并介绍了相关的应用实例。
荧光标记染料
染料在生物化学中最早的应用是直接对切片进行染色,然后对切片进行观察。随着生命科学的不断发展，以及计算机技术、激光技术、荧光光谱测定技术的不断进步，荧光染料在DNA测序、细胞检测、毒物分析、临床医疗诊断等方面得到了广泛的应用。荧光染料被核酸、蛋白质等大分子吸附或共价键结合后，其荧光特性发生改变，从而反应有关大分子特性的信息。图1列出了一些流式细胞仪中的荧光染料的激发和发射波长。
图1常用荧光染料的激发和发射波长
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪主要有四部分组成：流动室和液流系统、光源与光学系统、信号收集与信号转换系统、计算机与分析系统，图2为流式细胞仪基本结构。以激光照射高速流动状态下被荧光素染色的单细胞或颗粒，产生散射光和激发荧光。测量其产生的前向散射光和侧向散射光，反映细胞的大小和细胞的数量；测量激发荧光信号，反映荧光标记的特异信息。这些光信号被传送到计算机进行数据处理和分析。在一定程度上，单色激光源数量越多，可检测的内容也越多，检测信息越全面。
图2 为流式细胞仪基本结构
流式细胞仪的光路方案
传统流式细胞仪和全光谱流式细胞仪的光路方案如图3和图4所示，全光谱流式细胞仪的光路设计中包含光纤元件。图3中，光源发出的激光经准直、反射、整形后照射到流动池内的细胞上，光经过细胞散射后由散射光收集透镜收集、再经过高通滤光片、带通滤光片、带通范围内的复色光透射后再经聚焦透镜汇聚向探测器，最后经计算机处理完成细胞分析。图4中，光源发出的激光经准直、反射、整形后照射到流动池内的细胞上，激发的荧光通过光纤被捕获，经光纤光路引导系统后被模块化荧光分析设备处理，计算机给出最终分析。两种光路基本原理相同，但是光纤作为光路引导元件有两个明显优势。
图3 传统流式细胞仪光路 图4 全光谱流式细胞仪光路
首先，光纤引导元件使流式细胞仪的结构更加紧凑。由于光纤是柔性的，他可以将光传输至任意地方，这使波分复用元件、电子元件的摆放更具灵活性，极大拓展了流式细胞仪的空间利用率。
其次，光纤引导元件的应用提高了仪器设备的空间利用率，解决了流式细胞仪多色激光荧光的瓶颈问题。传统流式细胞仪在实现多色方案时会在流动池前后增加复杂的光路元件，而且传统流式细胞仪未采用光纤作为光路引导元件，且大多采用共线激光装置，这对激光数量、通道数量产生了限制，在多色激光器激发的荧光收集、波分复用等方面存在一定的技术局限，无法区分光谱相似的荧光染料，严重限制了荧光染料的选择和多色分析能力。例如，激光光源的配置主要有两种装置：共线激光装置（图5）和平行激光装置（图6）。平行装置中的激光器在空间上是分离的，细胞通过检测点时，一次暴露于一个激发光源。共线激光装置的激光器共用同一条光路，细胞同时被多个激光器激发。多色激光器作为光源激发共线激发时会存在一种特例：两种染料的激发波长不同而发射波长相近时，两种染料在相同波长处的发射光将不可区分。全光谱流式细胞仪利用光纤作为接收传输介质突破了传统流式细胞仪的技术局限，拓宽了流式细胞仪的检测通道数目，能够精确识别数种颜色荧光标记的细胞。
图5 共线激光装置 图6 平行激光装置
流式细胞仪用石英光纤制品
在实际应用中，上文提到的光纤为多模石英光纤，其丝径在200um-800um之间。常用荧光染料的荧光波长在350nm-800nm之间，一种实际应用在流式细胞仪中的多模光纤的衰减图谱如图7所示。在流式细胞仪的应用光谱范围内，该光纤的透过率高，其传输性能是满足要求的。
图7 光纤衰减图
流式细胞仪用多模石英光纤制品入光端的一种常见的排列如图8所示，三个用于荧光接收的光纤端面精密阵列在一条直线上，间隔依据多色激光的间距而定。图8所示为一种三激光光纤，在实际应用中可以根据激光色数改变光纤阵列数量，形成四光纤阵列、六光纤阵列等形式。
图8一种常见的排列形式
流式细胞仪用多模石英光纤制品的出光端连接至小型准直透镜，其一般形式为标准的SMA905接头。标准SMA905接头可将输出光作为通道扩展，如图9所示，输出光经波分多路器分为第一路荧光和第二路荧光后输出到光电探测器阵列。这种方式方便了仪器售后现场升级，满足由简至繁的多样化实验需求。
图9 流式细胞仪波分多路复用通道的装置
石英多模光纤在流式细胞仪中不仅可以作为荧光接收引导元件，还可以作为激光的输出元件。在一些设备中，光纤输出端做成实心球形，使出射光束产生汇聚后再发散传播，再在适当距离放置无芯光纤，让光束通过无芯光纤照射到流动池内的细胞上。
结语
多模光纤在流式细胞仪中的应用，优化了仪器系统的光路，大幅缩小了设备的几何尺寸，使流式细胞仪的结构更加紧凑、便携，尤其适用于在医疗急救环境，更加方便了在核心实验室和医院诊所内的使用。多模石英光纤的发展和加工制造水平的提高，也使得流式细胞仪三激光、四激光、甚至六激光方案成为可能，促进了流式细胞仪多色荧光分析的发展。现阶段，在迅速发展各项科学技术的影响作用下，流式细胞术的应用前景会更加广阔。
