引言：
黄曲霉毒素是由几种曲霉菌产生的有毒化合物。这些真菌可以在不同的条件下生长，但生长速度和黄曲霉毒素的产生取决于当前的物理、生物、生化和环境条件。已分离并鉴定出几种黄曲霉毒素；其中四种曲霉菌B1、曲霉菌B2、曲霉菌G1、曲霉菌G2是自然流行的。黄曲霉毒素是毒性最强的致癌黄曲霉毒素。
一、材料与方法
（一）材料
1、标准品
黄曲霉毒素B1（100μg/ml）、黄曲霉毒素G1（100μg/ml）、黄曲霉毒素B2（100μg/ml）、黄曲霉毒素G2（100μg/ml）
2、试剂
甲醇、乙睛、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、盐酸、TritonX-100
（二）溶液配制
乙睛一水溶液(84+16):取840毫升乙睛加入160毫升水。
甲醇一水溶液(70+30):取700毫升甲醇加入300毫升水。
乙睛一水溶液(50+50):取500毫升乙睛加入500毫升水。
乙睛一水溶液(10+90):取100毫升乙睛加入900毫升水。
乙睛一甲醇溶液(50+50):取500毫升乙睛加入500毫升甲醇。
（三）标准溶液配制
标准储备溶液(10μg/ml):分别取0.5毫升的AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2,分别用乙睛溶解并定容至5.0毫升。此溶液浓度约为10μg/ml。
混合标准工作液，乙睛定容。密封后避光一20℃下保存，三个月内有效。
标准系列工作溶液:分别l0μL,50μL,200μL,500μL,1000μL、2000μL,4000μL至10毫升容量瓶中。
（四）主要仪器设备
电子天平、涡旋混合器、均质器、离心机、液相色谱仪、免疫亲和柱子、一次性微孔滤头、离心管、移液枪、超纯水机
（五）样品定量分析方法
1、液体样品采样量需大于1L，对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号)，将所有液体样品在一个容器中用匀浆机混匀。
2、固体样品采样量需大于1kg，用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于2mm孔径试验筛。
（六）样品提取
1、植物油脂：称取5g试样于50毫升离心管中,加入20毫升乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀。
2、酱油、醋：称取5g试样于50毫升离心管中,用乙腈或甲醇定容至25毫升,涡旋混匀。
3、一般固体样品：称取5g试样于50毫升离心管中,加入20.0毫升乙腈-水溶液或甲醇-水溶液。
4、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品：称取5g试样于50毫升离心管中,加入20.0毫升乙腈-水溶液或甲醇-水溶液。
（七）样品亲和柱净化
1、3毫升柱管取出上方堵头，减去上堵头螺纹下突出部分，插回柱子上，另一端与20毫升针筒固定后使用；将1毫升柱管上方堵头取出后斜剪断，然后再插回柱子上；准确加入1.0毫升甲醇洗脱，流速自然重力。收集全部洗脱液，加入流动相混匀，过有机相滤膜后，参照GB5009.22-2016条件进行HPLC测定。
（八）最佳色谱条件：
色谱柱：InertsilODS-C18；
流动相：A相：水，B相：乙腈-甲醇；
流速：1.0毫升/min；
柱温：40℃；
检测波长：360nm;发射波长:440nm;
进样量：10µL。
（九）计算
样品中AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2的残留量计算公式如下：
X—试样中AFTB1、AFTB2、AFTG1或AFTG2的含量,单位为μg/kg
ρ—进样溶液中AFTB1、AFTB2、AFTG1或AFTG2,单位为ng/ml;
V1—试样提取液体积,单位为毫升
V3—样品经免疫亲和柱净化洗脱后的定容体积,单位为毫升;
V2—用于免疫亲和柱的样品体积,单位为毫升;
1000—换算系数;
m—称样量,单位为g。
二、方法验证实验
（一）线性情况
用系列标准工作溶液由低到高浓度依次进样检测，结果如下：
表1黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素B2标准系列与相应峰面积
标准系列浓度(ng/ml) | 黄曲霉毒素G2峰面积 | 黄曲霉毒素B2峰面积 |
0.03 | 510 | 675 |
0.15 | 920 | 2440 |
0.60 | 3550 | 10135 |
1.50 | 9075 | 24384 |
3.00 | 18039 | 49411 |
6.00 | 36045 | 96201 |
12.00 | 71747 | 193607 |
斜率 | 5986.65 | 16133.7 |
y轴截距 | 0 | 0 |
线性相关系数(r) | 0.9999 | 0.9999 |
表2黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B1标准系列与相应峰面积
标准系列浓度(ng/ml) | 黄曲霉毒素G1峰面积 | 黄曲霉毒素B1峰面积 |
0.10 | 701 | 1076 |
0.50 | 1707 | 5210 |
2.00 | 5882 | 20275 |
5.00 | 14966 | 49478 |
10.00 | 30235 | 97083 |
20.00 | 61617 | 196321 |
40.00 | 119507 | 387901 |
斜率 | 3006.90 | 9723.55 |
y轴截距 | 0 | 0 |
线性相关系数(r) | 0.9998 | 0.9999 |
（二）方法检出限
空白试样中添加适量浓度的标准贮备液，按上述样品制备提取得到检测分析加标图谱。当S/N约等于3时，黄曲霉毒G2、黄曲霉毒素B2最低检测浓度为0.01ng/ml；黄曲霉毒G1、黄曲霉毒素B1最低检测浓度为0.03ng/ml；采用的分析方法验证得出方法定量限为:黄曲霉毒G2、黄曲霉毒素B2定量限为0.03μg/kg；黄曲霉毒G1、黄曲霉毒素B1定量限为0.1μg/kg。
（三）精密度实验
为检验本方法的精密度，对同一样品进行7次进样分析,按照分析步骤进行测定，结果如下。
表3黄曲霉毒素G2测定
序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
黄曲霉毒素G2测定值（ng/ml） | 1.494 | 1.524 | 1.511 | 1.496 | 1.506 | 1.515 | 1.517 |
平均值 | 1.509 | ||||||
标准偏差 | 0.011 | ||||||
相对标准偏差% | 0.73 | ||||||
表4黄曲霉毒素G1测定
序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
黄曲霉毒素G1测定值（ng/ml） | 4.995 | 4.972 | 5.09 | 5.067 | 4.971 | 5.075 | 5.054 |
平均值 | 5.032 | ||||||
标准偏差 | 0.051 | ||||||
相对标准偏差% | 1.01 | ||||||
表5黄曲霉毒素B2测定
序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
黄曲霉毒素B2测定值（ng/ml） | 1.497 | 1.523 | 1.51 | 1.503 | 1.495 | 1.52 | 1.518 |
平均值 | 1.509 | ||||||
标准偏差 | 0.011 | ||||||
相对标准偏差% | 0.75 | ||||||
表6黄曲霉毒素B1测定
序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
黄曲霉毒素B1测定值（ng/ml） | 5.091 | 5.077 | 5.002 | 5.037 | 4.941 | 5.049 | 4.992 |
平均值 | 5.027 | ||||||
标准偏差 | 0.052 | ||||||
相对标准偏差% | 1.04 | ||||||
（四）准确度实验
1、实验测定对象选取黄曲霉毒素B1，分别加入100.0ng/ml，40μL低浓度（4ng）、1000.0ng/ml，225μL高浓度（225ng）黄曲霉毒素B1标准溶液，测得平均加标回收率为94%。
表7花生油为基质加标回收实验结果
称样量 （g） | 本底值(ug/kg） | 加标量(ug/kg） | 测定值 (ug/kg） | 加标回收率（%） | 平均加标回收率（%） | |
低浓度 | 5.0009 | 0.0000 | 0.7998 | 0.7483 |
93.9 |
94 |
5.0011 | 0.0000 | 0.7998 | 0.7543 | |||
高浓度 | 5.0008 | 0.0000 | 44.9928 | 42.5151 |
94.6 | |
5.0007 | 0.0000 | 44.9937 | 42.6270 |
2、为验证本方法的准确度情况，分别选取大米、瓜子、黄豆、酱油、婴幼儿食品（米粉）为基质加标，测试不同基质样品中的回收率：分别加入100.0ng/ml，50μL低浓度（5ng）、100.0ng/ml，250μL高浓度（25ng）黄曲霉毒素B1标准溶液,测得平均加标回收率为83%~89%。
表8大米为基质加标回收实验结果
称样量 （g） | 本底值(ug/kg） | 加标量(ug/kg） | 测定值 (ug/kg） | 加标回收率（%） | 平均加标回收率（%） | |
低浓度 | 5.0599 | 0.0000 | 0.9882 | 0.8597 |
87.3 |
86 |
5.0629 | 0.0000 | 0.9876 | 0.8671 | |||
高浓度 | 5.0008 | 0.0000 | 4.9992 | 4.2253 |
84.4 | |
5.0085 | 0.0000 | 4.9915 | 4.2238 |
表9瓜子为基质加标回收实验结果
称样量 （g） | 本底值(ug/kg） | 加标量(ug/kg） | 测定值 (ug/kg） | 加标回收率（%） | 平均加标回收率（%） | |
低浓度 | 5.0005 | 0.0000 | 0.9999 | 0.8859 |
89.1 |
89 |
5.0594 | 0.0000 | 0.9883 | 0.8865 | |||
高浓度 | 5.0489 | 0.0000 | 4.9516 | 4.4564 |
89.3 | |
5.0315 | 0.0000 | 4.9687 | 4.4112 |
表10黄豆为基质加标回收实验结果
称样量 （g） | 本底值(ug/kg） | 加标量(ug/kg） | 测定值 (ug/kg） | 加标回收率（%） | 平均加标回收率（%） | |
低浓度 | 5.0041 | 0.256 | 0.9992 | 1.0801 |
82.5 |
83 |
5.0033 | 0.256 | 0.9993 | 1.0883 | |||
高浓度 | 5.0012 | 0.256 | 4.9988 | 4.4649 |
83.9 | |
5.0022 | 0.256 | 4.9978 | 4.4281 |
表11酱油为基质加标回收实验结果
称样量 （g） | 本底值(ug/kg） | 加标量(ug/kg） | 测定值 (ug/kg） | 加标回收率（%） | 平均加标回收率（%） | |
低浓度 | 5.0025 | 0.0000 | 0.9995 | 0.8366 |
84.0 |
85 |
5.0049 | 0.0000 | 0.9990 | 0.8422 | |||
高浓度 | 5.0071 | 0.0000 | 4.9929 | 4.2699 |
86.0 | |
5.0092 | 0.0000 | 4.9908 | 4.3121 |
表12婴幼儿食品(米粉)为基质加标回收实验结果
称样量 （g） | 本底值(ug/kg） | 加标量(ug/kg） | 测定值 (ug/kg） | 加标回收率（%） | 平均加标回收率（%） | |
低浓度 | 5.0015 | 0.0000 | 0.9997 | 0.8497 |
84.9 |
85 |
5.0009 | 0.0000 | 0.9998 | 0.8488 | |||
高浓度 | 5.0073 | 0.0000 | 4.9927 | 4.2328 |
84.8 | |
5.0043 | 0.0000 | 4.9957 | 4.2304 |
三、结束语
定性和定量结果采用保留时间来定性。标样和样品溶液同时上机测定，分别进样10uL。利用保留时间一致性，采用外标法进行定量计算。结果4种黄曲霉毒素在40min内得到良好的基线分离,理论塔板数和分离度满足高效液相色谱法测定要求。黄曲霉毒素B1、G1的检出限为0.03μg/kg,黄曲霉毒素B2、G2的检出限为0.01μg/kg。加标回收率为83~94%,准确可靠,重现性好,适用食品中黄曲霉毒素B族和G族的日常检测。
参考文献：
[1]冯家畅.花生黄曲霉毒素的生物防控方法及菌剂的研究[D].吉林大学,2020.
[2]蒋采贝.乳酸菌对黄曲霉毒素B_1的吸附作用效果[D].上海海洋大学,2019.
[3]GB5009.22-2016,食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定[S].
[4]陈涛,李桓,陈大红,江虹.红茶中黄曲霉毒素B_1的测定方法探讨[J].海峡预防医学杂志,2016,22(06):51-53.