我国是肺结核的高发病国家，结核的发病率位于全球第二[1]。有研究报道早期分泌性抗原靶6 （early secretory antigenic target-6, ESAT-6）检测对肺结核尤其是痰涂阴性肺结核诊断的特异性和灵敏度较高，可作为诊断肺结核的辅助方法。目前临床使用的斑点实验计数就是选择ESAT-6蛋白在免疫细胞中的表达量。但ESAT-6的表达上调是否与疾病进展相关，目前没有该类研究。
本研究选取我院2018年1月-2019年1月收治的确诊肺结核患者92例，根据诊断分为痰涂阳性组50例及痰涂阴性组42例。选取门诊健康体检者19例作为对照组。通过外周血ESAT-6的检查与临床症状、检查结果进行比较分析，评估其诊断及判断预后的价值。
1 资料与方法
1.1 研究资料
肺结核患者92例，痰涂阳性组患者50例，其中男性35例，女性15例，年龄22-67岁，中位年龄39岁。痰涂阴性组患者42例，其中男性30例，女性12例，年龄20-64岁，中位年龄35岁。肺结核诊断标准按照2017年肺结核诊断标准（WS288-2017）[2]进行诊断。
门诊健康体检者19例，男性11例，女性8例，年龄25-62岁，中位年龄31岁。涂阳患者伴有肺外结核的有19例；涂阴患者伴有肺外结核的8例。影像学检查显示涂阳患者双肺结核的32例，肺结核伴空洞的有23例；涂阴患者双肺结核的23例，肺结核伴空洞的7例。所有研究对象均抽取6ml静脉血于肝素钠抗凝管中备用。该研究已通过医院伦理委员会审核，所有入组患者均签署知情同意书。
1.2 主要设备及试剂
1.2.1 主要设备
流式细胞分析采用美国BD公司FACSCalibur型流式细胞仪。电热恒温鼓风干燥箱：上海森信DGG-9140B。高速冷冻离心机：thermo scientific；移液器：eppendorff；海尔4℃/-20℃冰箱。酶标仪：美国Molecular公司生产，型号SPECTCA MAX190。
1.2.2 主要试剂
人ESAT-6酶联免疫分析（ELISA）试剂盒购自英国Oxford公司；其余T淋巴细胞亚群检测试剂购于美国Cloud Clone公司。
1.3 ESAT-6及T淋巴细胞亚群检测方法
酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)：取各组研究对象静脉血液3ml于肝素钠抗凝管中，4℃离心15min，离心转速为3000 r/min，离心半径为15cm。收集上清于冻存管中，置于-80℃冻存备用。ELISA法检测研究对象血浆中ESAT-6表达水平，操作过程严格按照试剂盒说明进行。使用ELISA calc软件根据标准品浓度和OD值做出标准曲线并计算回归方程，根据所得回归方程即可算出待测样本中ESAT-6的含量。
外周血T淋巴细胞亚群计数采用流式细胞分析仪(Beckman Coulte公司，美国)进行检测。流式结果的分析软件为Gallios软件1.0版(Beckman Coulter公司)。取抗凝血4ml，在6 h之内分离PBL，然后将PBL加入1.5 ml离心管中，用1ml荧光洗液(含2%NBS的0.15mol/L PBS，pH7.4)洗涤2次，洗涤时1000r/min，离心5min，弃上清，用200L荧光洗液重悬细胞。将每个样品的PBL进行CD3+，CD4+和 CD8+淋巴细胞亚群的检测。
1.4 统计学方法
应用SPSS 20.0统计分析软件进行分析，计量资料用表示，计数资料组间比较采用χ2检验；一致性检验采用kappa分析，组间比较进行独立样本t检验，相关性分析采用线性相关系数pearson进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1实验室检查结果比较
痰涂阳性组患者ESAT-6升高明显，痰涂阴性患者组也有升高，健康对照组未见升高（P<0.05）。免疫功能比较痰涂阳性组CD4及CD8下降明显，痰涂阴性组较健康对照组也有下降（P<0.05）。血常规中三组白细胞及中性粒细胞比率升高均不明显，两两比较无统计学意义（P<0.05）。
2.2 ESAT-6与免疫功能相关性分析结果
根据实验室结果分析后进一步进行ESAT-6与免疫功能的相关性分析，ESAT-6升高与免疫功能下降密切相关，两者存在明显负相关（r=-0.361，P=0.015；r=-0.425，P=0.012)。见表1。
表1 ESAT-6与免疫功能相关性分析结果
2.3 影像学检查结果比较
痰涂阳性患者双肺病变发病率明显高于痰涂阴性患者，但两组发病率比较没有统计学意义（P>0.05）。痰涂阳性患者常见空洞发生，肺外病变发生率也较痰涂阴性患者高，两组比较具有明显统计学意义（P<0.05）。见表2。
表2 影像学检查结果比较
注：两组比较，*P<0.05
3讨论
早期分泌抗原靶6(ESAT-6)家族也可以称为WXG家族蛋白，是指一类小分子蛋白(约100个氨基酸)，呈螺旋状结构，是由保守的Trp Xaa Gly(WXG)形成一个特征性的发夹[3]，主要在致病性的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）中表达。本研究结果显示，肺结核涂阳患者ESAT-6表达增高，较涂阴组患者增加明显，而在健康对照组中未见ESAT-6表达。有研究结果提示，ESAT-6为致病性MTB中的侵袭性蛋白，能帮助MTB免疫逃逸。
T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+均是T细胞重要的表面抗原标志，作为免疫效应细胞在直接杀伤靶细胞进行免疫调节等方面发挥着重要的功能[4]。MTB感染后首先攻击人体免疫细胞T淋巴细胞亚群，导致CD4+、CD8+分泌下降，出现免疫抑制。本研究结果显示肺结核患者无论涂阳或者涂阴患者免疫功能均有抑制。本研究结果显示ESAT-6表达与T淋巴细胞亚群表达呈负相关，提升ESAT-6表达越高，T淋巴细胞下降越明显。
肺结核的进展与患者的年龄、身体状况、药物治疗是否规范合理等密切相关。肺结核涂阳患者肺空洞发生率明显升高，结果比较具有统计学意义（P<0.05），提示肺结核涂阳患者处于疾病进展期，MTB的致病力较强。
综上所述，ESAT-6是从MTB短期培养滤液中分离出的低分子量分泌蛋白，与MTB的侵袭、肺结核的进展密切相关。进一步监测ESAT-6的表达量，可以评估病情及判断预后，值得进一步研究探讨。
参考文献
[1]孙雯雯,肖和平,吴福蓉,等.结核感染T 细胞斑点试验在临床诊断为肺外结核患者中的价值评价[J].中国防痨杂志,2015,37(7):784-789.
[2]高孟秋.《WS 288-2017肺结核诊断》新标准中关于临床诊断患者判定的解析[J].中国防痨杂志,2018,40(3):243-246
[3]Mustafa AS.Diagnostic and vaccine potentials of ESAT 6 family proteins encoded by M- tuberculosis genomic regions absent in M boris BCG[J]. Mycobac Dis,2013（3）:129．
[4]商勇,陆燕春,解承鑫,等.不同肺结核类型患者细胞免疫功能相关性研究[J].临床肺科杂志,2017,22(07):1176-1179.