前列腺癌是男性最常见的癌症之一，尤其是在发达国家，前列腺癌是第二大致死原因[1]。在中国，前列腺的年龄标准化死亡率呈上升趋势，目前最常应用的前列腺特异抗原 (PSA) 检测，其特异性并不十分理想。DNA甲基化属于表观遗传学范畴，目前发现DNA甲基化变化与和许多疾病的发生有关[2]。频繁的表观遗传改变可导致癌症的发生和发展，并与包括前列腺癌在内的许多癌症有关，可以通过检测患者血清中DNA甲基化水平变化，在前列腺癌病变早期无创筛查中有一定的价值。有研究发现，PCDH17 甲基化水平在泌尿系统肿瘤的不同分期间、肿瘤和正常组织间均呈现明显的差异，被认为可作为诊断泌尿系统肿瘤的敏感性和特异性指标[3]。本次研究将对前列腺癌患者血清中 PCDH17基因甲基化水平与前列腺增生患者相对比，并联系前列腺癌患者相关的临床病例资料，评估其对前列腺癌早期诊断的价值。
资料与方法
1标本收集
选取在2020 -01 ~ 2021- 01 期间，于佳木斯大学附属第一医院泌尿外科住院治疗，行经尿道前列腺切除术的患者，没有一个病人在手术前接受过任何种类的抗癌治疗。其中前列腺癌患者24例，前列腺增生患者26例，并具有组织学证实的非恶性前列腺组织。手术标本由本院3名高级病理学家审查复核，明确所有患者诊断和其Gleason评分。记录所有样本患者的年龄、术前PSA水平、病理分期。在手术前当天早上，所有受试患者采集新鲜全外周血样本(10毫升)。在以每分钟1800×重力离心10分钟之前，将所采样品静止凝固60分钟，并将上清液储存在-80℃。
1.2 DNA 提取及亚硫酸盐修饰
使用QIAmp DNA血液小试剂盒（Qiagen，Valencia，CA，USA）从0.8ml血清中提取循环DNA；准备2%的琼脂糖凝胶，用于电泳来观察 DNA 条带。收集到的DNA 样本使用上皮亚硫酸氢钠试剂盒（Qiagen，Valencia，CA，（美国）按前面所述的试剂盒制造商说明处理，置于－20℃保存[4]。
1.3 甲基化特异性 PCＲ
以上述经处理后的 DNA 作为模板，引物的使用与以前报道的一样,序列甲基化:正向5’-GATTATCGGGTGTCGTAGTTC-3’和反向5’-CCCTAACGCAACGTACGCG-3’和未甲基化:正5’-AGATTATTGGGTGTTGTAGTTT-3’和反向5’-AACCCTAACACAACATACACA-3’[5]；进行甲基化 PCＲ反应 。PCＲ 结束后，PCR产物在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳分离，紫外线下观察结果并截取图片[6]。
1.4 统计学方法
前列腺癌患者和对照组PCDH17甲基化的差异通过Fisher精确检测进行评估。PCDH17甲基化与临床病理特征之间的关系通过卡方检验进行评估。数据结果用SPSS 21.0软件进行分析。P<0.05有统计学意义。
2 讨论
2.1血清样本中PCDH17的甲基化状态
前列腺癌患者血清样本24例中检测出PCDH17甲基化阳性14例(58.3%)，见图一。所有26例前列腺增生患者PCDH17甲基化检测阴性，差异有统计学意义(P<0.05)。
图一 24例前列腺癌患者的血清中PCDH17基因甲基化状态
2.2 PCDH17甲基化与临床病理特征的相关性
我们将24例前列腺癌患者血清中PCDH17的甲基化水平与前列腺癌患者的临床病理资料综合分析。前列腺癌患者在病理分期、Gleason 评分， PSA水平差异有统计学意义（p＜0.05），而在年龄和淋巴结转移无统计学意义（p＞0.05）。这些发现见表一。
表一24例前列腺癌患者临床资料
3 讨论
前列腺癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，恶性肿瘤的早期诊断十分重要，当前用于前列腺癌诊断的PSA特异性有限，不能有效在前列腺癌患者早期诊断时区分其是否为侵袭性肿瘤[7]。因此，有迫切需要开发敏感的、非侵入性的、有成本效益的早期预后生物标志物。患者血清中DNA甲基化失常，导致抑癌基因的沉默，致使癌症的一系列发展，因此DNA甲基化可能和其他生物标记物相结合作为前列腺癌患者诊断的的候选物[8]。已有文献表明，DNA甲基化不仅可以在前列腺癌组织中检测到，并且可以在人的体液中有发现，如尿液中，从而可以开发非侵入性生物标志物。并可能有助于开发人类癌症的临床相关生物标志物[9]。
在本次实验中，我们对24例前列腺癌患者和26例前列腺增生患者的血清样本进行了PCDH17的甲基化水平检测。据相关文献报道，PCDH17在泌尿系统癌症中高甲基化[10]。我们的数据表明，24例前列腺癌患者血清中有14例患者检测出PCDH17甲基化（58.3%），但在对照组中未发现PCDH17甲基化。前列腺癌患者和对照组血清中PCDH17甲基化的差异非常显著。由于DNA甲基化在肿瘤的发生和发展中起着重要作用，我们进一步探讨了前列腺癌患者PCDH17甲基化的临床病理意义。根据我们的实验数据分析发现，PCDH17甲基化阳性组和对照组在PSA水平、病理阶段、Gleason 评分方面差异具有统计学意义。所以：前列腺癌患者血清中若检出 PCDH17基因甲基化阳性，则需考虑存在前列腺癌的可能，对前列腺癌患者的早期诊断具有一定意义[11]。
我们的研究有一些局限性。我们的队列仅由24名前列腺癌患者组成，研究对象样本量较少，后续需要更多的样本数量研究来验证我们的发现，该研究仅确定了1个候选标志物。因此，需要前瞻性研究来确定更多的脱氧核糖核酸甲基化，作为一个小组，这些甲基化可能具有更高的预测能力。无论如何，血清中PCDH17甲基化检测最显著的特点是高效、快速、低成本和非侵入性，因此证明了其在未来的潜在应用。
参考文献
[1] Mattiuzzi Camilla,Lippi Giuseppe. Cancer statistics: a comparison between World Health Organization (WHO) and Global Burden of Disease (GBD).[J]. European journal of public health,2020,30(5).
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[3]Luo ZG, Li ZG, Gui SL et al: Protocadherin-17 promoter methylation in serum-derived DNA is associated with poor prognosis of bladder cancer. J Int Med Res, 2014; 42(1): 35–41.
[4]吴旭鹏,郭玉刚,牛文斌.前列腺癌患者血清PCDH10甲基化检测及临床意义[J].黑龙江医药科学,2016,39(04):120-121+123.
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[6]Niu WB, Gui SL, Lin YL et al: Promoter methylation of protocadherin8 is an independent prognostic factor for biochemical recurrence of early-stage prostate cancer. Med Sci Monit, 2014; 20: 2584–89.
[7]Andrea K. Miyahira PhD,Adam Sharp MD, PhD,Leigh Ellis PhD,Jennifer Jones MD, PhD,Salma Kaochar PhD,H. Benjamin Larman PhD,David A. Quigley PhD,Huihui Ye MD,Jonathan W. Simons MD,Kenneth J. Pienta MD,Howard R. Soule PhD. Prostate cancer research: The next generation; report from the 2019 Coffey‐Holden Prostate Cancer Academy Meeting[J]. The Prostate,2020,80(2).
[8]Siri Strand,Torben Orntoft,Karina Sorensen. Prognostic DNA Methylation Markers for Prostate Cancer[J]. IJMS,2014,15(9).
[9]Dietrich Dimo. DNA Methylation Analysis from Body Fluids.[J]. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.),2018,1655.
[10]Vera L. Costa,Rui Henrique,Stine Aske Danielsen,Mette Eknaes,Patrícia Patrício,António Morais,Jorge Oliveira,Ragnhild A. Lothe,Manuel R. Teixeira,Guro E. Lind,Carmen Jerónimo. TCF21 and PCDH17 methylation: An innovative panel of biomarkers for a simultaneous detection of urological cancers[J]. Epigenetics,2011,6(9).
[11]刘绍祖. PCDH10基因在前列腺癌组织中的甲基化测定及临床意义[D].辽宁医学院,2014.
作者简介：周勇( 1994 ～ ) 男，四川巴中人，在读硕士研究生。
通讯作者：牛文斌( 1972 ～ ) 男，黑龙江佳木斯人，博士，副主任医师，硕士研究生导师。