活络镇痛片为中药成方制剂，收载于《国家药品标准》。是属于中成药类非处方药物，其作用主要用于闪腰岔气、淤血作痛，筋骨疼痛、腰痛、腿痛等症状的治疗。活络镇痛片是复方制剂，药物组成包括天南星、红花、防风、白芷、当归等。[1]根据活络镇痛片给药途径和处方，应进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌数的测定以及控制菌（耐胆盐革兰阴性菌 、大肠埃希菌、沙门菌）的微生物限度检查。
1 试验仪器、材料与方法
1.1 试验仪器
BSC-1360IIA2生物安全柜（北京东联哈尔），IC812C电热恒温培养箱（雅马拓），IN612C低温恒温培养箱（雅马拓）SQ510C立式高压蒸汽灭菌器（雅马拓），JY20002分析天平（上海良平）。
1.2 试验材料
1.2.1 培养基、稀释剂 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基、肠道增菌液体培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、RV沙门增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 。均购于北京陆桥技术有限责任公司，以上培养基均通过了适用性和灵敏度检查。
1.2.2 菌种 白色念珠菌[CMCC(F)98001]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、 乙型副伤寒沙门菌［CMCC( B) 50094］，均为不超过5代的药典规定的试验菌株且购自中国食品药品检定研究院。
1.2.3 样品 活络镇痛片（津药达仁堂集团股份有限公司隆顺榕制药厂 规格为0.61g）
2 方法与结果
2.1 方法
2.1.1 菌液的制备
按照《中国药典》2020年版(四部)通则1105、1106项下方法制备菌液[2]。
2.1.2 供试液的制备
取活络镇痛片样品10g，加入100mLTSB中，振荡混匀，制成1∶10的供试液。取 1∶ 10供试液2 ml，加入TSB 8 ml中，振荡混匀，得到 1∶50 供试液。取 1∶ 10供试液1ml，加入TSB9 ml中，振荡混匀，得到 1∶100 供试液。[3]
2.1.3 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验
（1）试验组：常规法 取1:10供试液 9.9 mL，每批5份，每份加入铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌及黑曲霉的菌液0.1mL，[3]使供试液每1mL含菌量不大于100 CFU。充分混匀，吸取1mL，分别注入平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每份平行制备2个平板，33.0℃ 培养3d，测定需氧菌总数。取1:10供试液9.9 mL，每批2份，每份加入白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1 mL，使供试液每1mL含菌量不大于100 CFU。充分混匀，吸取 1mL注入平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每份平行制备2个平板，23.0℃ 培养5d，测定霉菌及酵母菌总数。稀释法：分别取“2.1.2”项下的 1∶ 50和1:100供试液 ，按上述方法操作。中和剂法：取本品10g，加含5%聚山梨酯80的胰酪大豆胨液体培养基稀释至100ml，置 45℃水浴中，振摇，制成1：10供试液，按上述方法操作。
（2）菌液组：用TSB代替供试液，同试验组操作。（3）供试品组：取“2.1.2”项下的 1 ∶10 供试液 1 ml，注入平皿中，立即倾注相应的培养基，培养条件条件同实验组，测定样品中的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数。（4）中和剂对照组：取含5%聚山梨酯80的胰酪大豆胨液体培养基代替供试品同试验组操作。
2.1.4控制菌检查方法的验证
2.1.4.1 耐胆盐革兰阴性菌
（1）试验组：取1:10供试液10ml两份，分别加入规定量大肠埃希菌和铜绿假单胞菌（均不大于100cfu），23.0℃培养2小时。取经预培养2小时的供试液用肠道菌增菌液体培养基10倍稀释至1:100和1:1000的供试液，取上述3个稀释级的供试液各1ml分别接种至10ml肠道菌增菌液体培养基中，33.0℃培养24小时。（2）阳性对照组：取TSB9.9ml两份，分别加入规定量大肠埃希菌和铜绿假单胞菌（均不大于100cfu），同试验组稀释培养。依相应检查法进行适用性检查。（3）实验结果：阳性对照组检出大肠埃希菌和铜绿假单胞菌；试验组检出大肠埃希菌和铜绿假单胞菌。方法适用性试验结果符合要求。
2.1.4.2 大肠埃希菌
（1）试验组：取1:10的供试液10ml和不大于100cfu大肠埃希菌悬液，加入100mlTSB中，33.0℃培养18小时。（2）阳性对照组：取规定量大肠埃希菌悬液（不大于100cfu），加入100mlTSB中，同试验组稀释培养。依相应检查法进行适用性检查。（3）实验结果：阳性对照组与试验组均检出大肠埃希菌，方法适用性试验结果符合要求。
2.1.4.3沙门菌
（1）试验组：取本品10g和规定量沙门菌（不大于100cfu）加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，33.0℃培养18小时。（2）阳性对照组：取规定量沙门菌（不大于100cfu）加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，同试验组稀释培养。依相应检查法进行适用性检查。（3）实验结果：试验组与阳性对照组均检出沙门菌。方法适用性试验结果符合要求。
2.2 回收率测定结果 回收比值 = ［(试验组平均菌落数 －供试品组平均菌落数) / 阳性对照组平均菌落数］ 。 按《中 国药 典》 2020 年版四部“1105、1106、1107”项下 规定进行结果判断，回收率比值应在 0．5 ～2 之间。
验证结果显示：常规法1∶10供试液需氧菌总数测定，枯草芽孢杆菌回收率比值均为 0，其他各菌回收率比值均达到试验要求，1:50、1∶100 供试液需氧菌总数枯草芽孢杆菌回收比值分别为 0．1和0.3，回收比值也未达到试验要求 ；试验结果如表1-2 所示，采用 1∶10 供试液（含5%聚山梨酯），需氧菌总数枯草芽孢杆菌回收比值达到试验要求，其他各菌回收率比值均达到试验要求。1∶10 供试液（含5%聚山梨酯）霉菌和酵母菌总数测定，两种菌回收率均达到试验要求。控制菌检查结果均有菌生长，菌落形态符合相应菌落特征。[4]
三批试验的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性检测的回收比值见表 3，控制菌的方法学适用性试验结果如表 4 － 6 所示。[5]
表1需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数常规方法回收比值
表 2 供试液稀释法需氧菌总数回收比值
表 3 1:10（含5%聚山梨酯）供试液需氧菌总数回收比值
表4耐胆盐革兰阴性菌方法学适用性试验结果
表5大肠埃希菌试验结果
表6沙门菌方法学适用性试验结果
2.3活络镇痛片微生物限度检查结果及分析
根据《中国药典》 2020 年版四部通则 1105 规定，3批次样品回收比值均在 0． 5 ～ 2 范围内，可认为该供试品的制备方法和计数方法适用于该样品的菌落计数。控制菌试验组均检出试验菌，阴性对照无菌生长，可采用常规法检查。
3讨论
依照《中华人民共和国药典》2020 年版四部的规定：在微生物限度检查时，需要判断供试品对试验菌种是否有抗菌活性，如有则要选择合适的方法先消除或中和其抗菌活性再进行检查，以保证方法的适用性。结果显示，活络镇痛片对细菌具有一定的抑制作用，1:10、1:50和1:100供试液需氧菌总数枯草芽孢杆菌的回收比值均低于0.5，聚山梨酯80对药品抑菌性的中和作用，多有报道及阐述,[6]含5%聚山梨酯80的胰酪大豆胨液体培养基制备1∶ 10 供试液可中和抑菌性。采用三批样品进行重复试验，保证了检查方法的科学有效。药品微生物限度检查是保证用药的有效性、保障药品安全性的重要措施[7]。针对活络镇痛片微生物限度检查的试验方法，精准消除一些干扰因素，使操作简捷，结果精确，提高药品的检测质量，为相似药品微生物限度检查方法适用性试验提供参考。
参考文献
[1]国家药典委员会. 中华人民共和国国药典. 四部［M］. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 160-170
[2]解 慧，郭福庆，补肾强身片微生物限度检查方法研究及质量分析 [J]天津药学 2018，30 （1）14-19.
[3]中国食品药品检定研究院.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药科技出版社,2019:444-447.
[4]黄燕，戴余雯，周素琴等.赤芍桃仁颗粒微生物限度检查方法适用性试验研究.甘肃医药 2021，40（ 7）635-638
[5]王洪家.解毒散结颗粒《中国药典》2015 年版微生物限度检查方法学验证［J］.天津药学，2016，06（4）.17-19.
[6]廖祥茹, 陈晨 ,李旸 ,陈鹰.聚山梨酯 80 在微生物限度检查中的应用.中国药师 2014, 17 (10).1776-1777
[7]胡昌勤.药品微生物控制体系建设现状与展望[J].中国现代应用药学,2021,38(5):513-519.