结核性胸膜炎（Tuberculous pleurisy，TP）属于第5型肺结核[1]，是由于结核分枝杆菌直接感染和（或）其菌体或菌体自溶产物、代谢产物等进入胸膜腔导致迟发型变态反应而形成的炎症，在此感染状态下胸膜通透性增强，从而导致胸腔积液即结核性胸腔积液（Tuberculous pleural effusion，TPE）的产生。TP的诊断通常依据胸腔积液发现病原学证据、分子生物学证据或病理学证据，然而抗酸染色阳性率低、敏感度差，分子生物学检查成本较高、假阳性率高，免疫学检测耗费时间长，胸膜活检技术要求高、价格昂贵且为有创检查[2-5]，临床检验较难形成确诊证据，尤其难适用于基层医院。
一直以来，积液细胞学检验的诊断价值因部分细胞识别难度较大、耗费人工时间精力较多等原因被低估。调研发现，部分实验室对积液细胞学检验重视程度不足，甚至存在某些问题[6]。然而有研究结果显示积液中淋巴细胞比例升高对结核性积液有较显著的提示作用[7]。因此为进一步探索积液细胞学检验在TP诊断中的临床意义，评价其联合其他实验室检查建立Logistic预测模型对TP的诊断效能，从而方便基层医疗单位推广应用，设计本实验开展研究。
1 资料与方法
1.1 资料
选取2021年3月至2022年3月就诊于济宁市公共卫生医疗中心的胸腔积液临床病例100例，其中结核组53例，男39例，女14例，年龄32~60岁；非结核组47例，男34例，女13例，年龄23~69岁。诊断标准[8]：胸腔积液或胸膜活检标本培养阳性，菌种鉴定为结核分枝杆菌，或胸膜活检组织符合结核改变；影像学检查显示胸腔积液，结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验中度阳性/强阳性，或干扰素释放试验阳性，或结核分枝杆菌抗体阳性。
1.2 方法
①细胞学检验：积液经涂片行Wright（瑞特）染色后置显微镜油镜下观察计数200个有核细胞并进行分类，记录淋巴细胞（Lymphocyte, LY）、间皮细胞（Mesothelial cells, ME）、巨噬细胞（Macrophage, MA）、中性粒细胞（Neutrophil, NE）等各类细胞百分比，观察有无反应性淋巴细胞/淋巴母细胞及核异质间皮细胞；②胸腔积液腺苷脱氨酶（Adenosine deaminase，ADA）检测：使用贝克曼AU5800全自动生化分析仪检测（过氧化物酶法，试剂均为原装配套），正常参考范围为≤35U/L；③结核感染T淋巴细胞斑点试验（T-SPOT.TB）：通过酶联免疫斑点法检测样本淋巴细胞中结核分枝杆菌特异性的T细胞免疫反应；④结核分枝杆菌/利福平耐药基因（Xpert MTB/RIF）检测：使用GeneXpert检测系统体外定性检测样本中的结核分枝杆菌复合物DNA和利福平耐药相关的rpoB基因突变。
1.3 统计分析
使用SPSS19.0对实验数据进行分析，计量资料以x̄±s表示。对实验组及对照组各类细胞百分比及ADA进行独立样本T检验，分析组间数据有无统计学差异（p＜0.05）；对实验组及对照组淋巴细胞百分比与ADA、T-SPOT.TB、Xpert MTB/RIF检测结果进行Pearson相关分析，分析数据是否存在相关性；对实验组及对照组各类细胞百分比及ADA、T-SPOT.TB、Xpert MTB/RIF检测结果进行ROC曲线绘制，分析不同项目对TP的临床诊断意义；通过Logistic二元回归分析构建临床预测模型并评价其诊断效能。
2 结果
2.1 独立样本T检验：如表1所示，两组间ADA水平及LY%、ME%、MA%、NE%均有统计学差异（P＜0.05）。两组均有个别病例中反应性淋巴细胞/淋巴母细胞、核异质间皮细胞偶见或可见，不具备统计分析意义。
表1 实验组与对照组各类细胞百分比及ADA对比分析
2.2 Pearson相关分析：LY%与ADA（r=0.267，p=0.007）、T-SPOT.TB（r=0.546，p=0.000）在0.01水平（双侧）上显著相关，LY%与Xpert MTB/RIF（r=0.240，p=0.016）在0.05水平（双侧）上显著相关。
2.3 ROC曲线绘制：如图1及表2所示。
图1 不同指标单独检测诊断TP的ROC曲线
表2 各项目单独检测诊断TP的AUC、置信区间、敏感度及特异度
2.4 Logistic回归分析建立临床预测模型
经Logistic二元回归分析以细胞学检验项目建立模型：Logit(P)=4.720-1.365*LY%-9.878*ME%-4.569*MA%-11.389*NE%，经绘制ROC曲线判断该模型预测效果：AUC为0.868 [95%CI (0.801~0.936)]，敏感度71.7%，特异度89.4%；以ADA联合细胞学检验项目共同建立模型：Logit(P)=-5.181+7.235*LY%-3.349*ME%+3.962*MA%-1.053*NE%+0.055*ADA，经绘制ROC曲线判断该模型预测效果：AUC为0.920 [95%CI (0.868~0.973)]，敏感度90.6%，特异度80.9%；以ADA联合积液淋巴细胞百分比建立模型：Logit(P)=-5.242+7.455*LY%+0.054*ADA，经绘制ROC曲线判断该模型预测效果：AUC为0.915 [95%CI (0.859~0.971)]，敏感度86.8%，特异度83.0%。
图2 细胞学项目及联合ADA检测诊断TP的ROC曲线
3 讨论
正常情况下胸膜腔内存在少量液体，在呼吸运动时起润滑作用，病理情况下形成胸腔积液，这是多种疾病常见的并发症[9]。胸腔积液按性质不同分为漏出液和渗出液：漏出液多是通过毛细血管滤出的非炎性积液，而渗出液最常见于TPE [10]。而合理推广快速、准确、高效的结核性胸膜炎诊断技术，及早发现该类患病情况，是提高疗效、改善预后的基础。
目前针对TPE开展的实验室检查项目有很多，包括①常规检验和基础生化检验，包括积液一般性状（颜色、透明度、凝固性）检查，细胞数量及分类，pH值，蛋白质含量等检查；②ADA检查：ADA是一种人体细胞中广泛存在的酶，与机体细胞免疫活性有关，是TP诊断目前公认的有效指标[11]，因价格经济、易于操作而在各级各类医疗单位广泛应用；③T-SPOT.TB：一种新型技术，通过检测全血或胸腔积液中的致敏T淋巴细胞从而对结核病进行提示诊断，是诊断结核菌感染目前公认的有效指标，主要原理是机体受结核分枝杆菌特异性抗原刺激产生活化效应T细胞释放γ-干扰素，通过检测特异性抗原（ESAT-6、CFP-10），利用ELISPOT技术判断患者结核感染的可能性[12]；④Xpert MTB/RIF：该项技术是由美国Cepheid公司研发、由世界卫生组织（WHO）推荐的半巢式实时荧光PCR检测方法，此方法不仅能明确样本中是否存在结核分枝杆菌DNA，而且能明确其是否对利福平耐药[13]。最后这两类新型技术虽已逐渐获得广泛推广，但主要是被引入到结核病实验室，一般医疗机构并不多见，且二者均有较显著的弊端：T-SPOT.TB试验耗费时间过长（48h）；Xpert MTB/RIF虽然较快速（2h），但仪器与试剂价格昂贵。因此，虽然目前TP诊断可以应用T-SPOT.TB、Xpert MTB/RIF等先进技术，但其不适合基层医疗单位开展。而鉴于TP诊断的复杂性，临床鼓励通过多项实验室检查结果进行综合分析，以提高检查的敏感度和特异度，尤其提倡应用基础性强的检验技术，以适应基层医院诊疗条件。
细胞形态学检验被誉为某些临床疾病诊断的“金标准”。积液细胞学检验应用Wright染色或Wright-Giemsa（瑞-吉）染色，通过对细胞核、细胞质、细胞整体及排列方面的综合观察对各类细胞进行识别并分类，相比免疫学及分子生物学等检查，具有操作简便、检测快速、结果直观等特点。但目前而言，基层医疗单位检验人员细胞形态识别能力有待提高，且部分实验室对积液仅开展湿片检查而未能精确计数各类细胞比例，这两方面工作还有待进一步改善提升。
本实验基于细胞学检验对TPE进行研究，主要研究淋巴细胞（LY）、间皮细胞（ME）、巨噬细胞（MA）、中性粒细胞（NE）百分比在TPE中的变化，以及细胞学检验数据与ADA、T-SPOT.TB、Xpert MTB/RIF等生物化学、免疫学、分子生物学检验数据进行比较，分析数据间的差异性、相关性及联用可能性，取得了预期进展，且有一些新的发现：一方面，LY百分比在TPE中有明显的升高，其可能机制是结核菌感染或结核菌素刺激浆膜周围淋巴组织，引起迟发型变态反应，从而导致淋巴细胞增生并通过毛细淋巴管输入浆膜腔。另一方面，积液LY百分比与ADA水平呈现显著相关性，主要原因系ADA本身可由淋巴细胞产生，尤其与T细胞活化有关，并对淋巴细胞的分化发挥重要作用[9]。再者，通过对不同指标绘制ROC曲线发现：Xpert MTB/RIF虽然特异度非常高（100%），但敏感度差（26.4%），诊断效能并不好（AUC 0.632），这与Han等[14]的研究结果接近，也因此该作者提出不建议将Xpert MTB/RIF作为诊断结核性胸膜炎的首选检查；T-SPOT.TB完全体现了免疫法的优势（AUC 0.970，敏感度96.2%，特异度97.9%），但如前文所说，其检测时间耗费过长，弊端同样显著；而ADA和LY%作为基层医院易开展的基础性实验，均具有较高的诊断效能（AUC分别为0.863和0.850）和较好的敏感度（86.8%，71.7%）、特异度（83.0%，80.9%）。最后，经Logistic二元回归建立临床预测模型，如仅纳入积液细胞学检验项目即各类细胞百分比，最终模型诊断效能为AUC 0.868，敏感度71.7%，特异度89.4%；如纳入ADA和各类细胞百分比，模型诊断效能为AUC 0.920，敏感度90.6%，特异度80.9%；如仅纳入ADA和淋巴细胞百分比，模型诊断效能为AUC 0.915，敏感度86.8%，特异度83.0%。以上三项Logistic模型综合诊断效能均高于任一单项检测，说明积液细胞学检验项目在TP诊断中有良好的提示作用。相较仅应用细胞百分比建立模型，纳入ADA后的诊断效能更加显著。而考虑到实验操作的简单便捷性，更推荐应用纳入ADA和淋巴细胞百分比二者的Logistic模型进行临床预测。
综上所述，本项研究表明，积液淋巴细胞比例升高对于TP诊断有显著的提示作用，其联合ADA共同检测具有较高诊断效能，虽不能作为确诊依据，但可及早提示病患从而及时诊治，尤其是对于基层医疗单位而言，积液细胞学检验可操作性强，且简便快速、成本低廉，非常值得推广。
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