文章-世纪中文出版社

张云彤王瑞楠孙墨楠贾惠舒李晓薇刘伟灿李海燕《生物技术研究》 2019年7期

摘要:

杂草生长茂盛给农田经济造成了巨大的损失,而草甘膦的高效除草则有利于防治农业杂草。培育抗草甘膦作物也为农业杂草管治带来了便利。近年来,已从微生物、植物中均挖掘到了草甘膦抗性基因并用于开发抗草甘膦转基因作物,该文根据这些抗性基因作用的不同机制总结了抗草甘膦转基因作物的育种策略及其利弊,并对未来抗草甘膦作物的发展方向进行讨论。

CRISPR/Cas9编辑雪兔Corin基因载体的构建下载：75 浏览：484

王海禄李杰尹俊《生物技术研究》 2019年6期

摘要:

通过CRISPR/Cas9系统构建雪兔Corin基因编辑载体。[方法]通过在线CRISPR设计工具设计2个靶点,退火制备sgRNA双链,用BbsⅠ酶得到线性p X330载体后,经重组酶连接得到重组质粒。将重组质粒转化到DH5α感受态细胞,再对其进行PCR鉴定及测序比对分析。[结果]通过特异性扩增以及测序结果表明sgRNA准确地连入载体,插入序列无突变,与预期序列高度一致,重组子阳性率为100%。[结论]成功构建了雪兔Corin基因敲除载体,为进一步利用CRISPR/Cas9技术进行雪兔Corin基因编辑工作提供了研究基础。

NF-κB1基因干扰质粒的构建及其对DEV增殖的影响下载：76 浏览：494

贺欣薇1 郑敏2 胡安东1 杨颖3,4 周碧君3,4 程振涛3,4 文明3,4 《生物技术研究》 2019年6期

摘要:

探究NF-κB对DEV增殖是否有影响。[方法]以NF-κB1基因作为靶基因,设计并构建4个不同p GPU6/GFP/Neo shRNA表达载体,通过荧光显微镜法观察转染后细胞荧光密度和RT-PCR检测转染细胞NF-κB1基因转录水平以筛选最佳干扰质粒,分3种不同组别进行干扰实验后,以荧光定量PCR法检测DEV-NP基因表达变化。[结果]所构建的重组质粒p GPU6/GFP/Neo-NF-κB1-2对细胞NF-κB1基因的干扰效率最高,可达78. 77%;除先感染后干扰组对DEV增殖影响不大外,先干扰后感染组与同时感染和干扰组均对DEV增殖呈现出一定的抑制作用,其中先干扰后感染组在第72 h时的沉默效率最高,可达78%,而同时感染和干扰组于第48 h时的沉默效率最高,可达82%。[结论]RNA干扰下调NF-κB1基因会抑制DEV增殖。

黄瓜Cu/Zn-SOD基因克隆及可溶性表达和纯化下载：83 浏览：495

陈梦瑶冯超越南天豪陈星辉冯雨彤朱振洪《生物技术研究》 2019年6期

摘要:

克隆黄瓜Cu/Zn-SOD基因,并利用大肠杆菌进行可溶性表达、纯化及活性测定。[方法]采用Trizol法提取黄瓜表皮的总RNA,然后设计特异性引物,通过RT-PCR技术克隆获得黄瓜Cu/Zn-SOD基因。该基因与p GEX2T载体相连后,转化大肠杆菌BL21(DE3),摸索可溶性表达方法。利用GST亲和层析方法纯化目标蛋白,SOD酶活性测定采用邻苯三酚法。[结果]成功地克隆了全长为459 bp的黄瓜Cu/Zn-SOD基因,编码152个氨基酸。Protein Blast分析表明其结构域中分别包含Cu2+、Zn2+结合位点,为典型的Cu/Zn-SOD酶。目标蛋白可溶性表达条件是16℃、0. 1 mmol/L IPTG诱导20 h。SDS-PAGE分析表明GST亲和层析成功地获得重组黄瓜Cu/Zn-SOD。活性测定表明两次纯化的蛋白样品SOD酶活力分别为2 328. 9 U/m L、2 144. 7 U/m L。[结论]从黄瓜表皮中克隆获得Cu/Zn-SOD基因,该基因在大肠杆菌系统中获得可溶性表达,纯化后的重组蛋白具有较高的SOD酶活力。

小叶章PPDK基因的克隆和生物信息学分析下载：81 浏览：483

王丽媛张玉徐明怡伍一宁冷海楠许楠倪红伟《生物技术研究》 2019年5期

摘要:

获得小叶章PPDK的cDNA序列,推测蛋白氨基酸理化性质及二三级结构等,以及已知物种PPDK氨基酸系统进化分析。[方法]利用RT-PCR技术扩增PPDK序列,通过ProtParam、Blast、THMHMM、SOPMA等生物信息软件分析序列。[结果]获得了小叶章PPDK的c DNA序列,长1 035 bp,相对分子量41. 910 kDa,等电点为9. 70,氨基酸中含量最高的是丝氨酸,72个;蛋白二级结构中无规卷曲占48. 83%,不含信号肽和跨膜结构,氨基酸系统进化树结果分析发现小叶章PPDK与二穗短柄草、水稻亲缘关系最近。[结论]小叶章PPDK含有385个氨基酸,含1个PDRP活性调控位点,72个参与信号传导的磷酸化位点。

“知—行”合一视角下的乡村振兴规划反思与探索下载：41 浏览：421

闫琳《中国城镇》 2019年10期

摘要:

我国乡村社会的发展,体现了上千年农耕文明文化之根与最宏大快速城镇化进程之间的冲突与博弈。随着乡村振兴成为我国最重要的国家战略之一,我国乡村空间正在经历一场颠覆性的变革。乡村振兴的未来必然是时代发展特征、人们认知变化与社会发展期望相融合的结果。在当前城乡融合的大背景下,深度认知乡村的复杂性与变化性,并与实践及行动相结合,探索"知—行"合一的乡村振兴发展方向与规划路径,是本文研究的核心目的。笔者结合十余年乡村研究和规划工作实践,从"知"的方面,深化认识我国乡村地区的独特乡土基因和随时代而变化的发展趋势;从"行"的方面,反思以往乡村规划与建设中的问题与原因;最后从四个方面探讨性提出了未来"知—行"合一的乡村振兴规划方向,力图能为当前乡村振兴发展提供若干思路。

单增李斯特菌lmo2192基因克隆与表达下载：81 浏览：483

李红欢马勋钱凌霄李庆辉刘扬扬《生物技术研究》 2019年3期

摘要:

对单增李斯特菌新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2的lmo2192基因进行克隆及原核表达。[方法]利用PCR方法扩增lmo2192基因,连接p MD19-T载体进行克隆,筛选阳性菌进行测序比对。构建重组表达质粒p ET32a-2192,将其转入大肠杆菌感受态细胞,经诱导表达,利用SDS-PAGE与Western Blotting鉴定重组蛋白。[结果]扩增lmo2192基因序列长度为969 bp,与预期一致。该基因在大肠杆菌中大量表达,经SDS-PAGE和Western Blotting鉴定分析该产物为56 k Da左右的融合重组蛋白,与预期大小一致。[结论]成功克隆lmo2192基因,并获得大量表达,为进一步研究该基因功能奠定理论基础。

发育期火龙果内参基因的筛选和验证下载：86 浏览：485

崇慧影文晓鹏《生物技术研究》 2019年2期

摘要:

筛选火龙果果实发育期稳定表达的内参基因。[方法]以火龙果不同发育时期的果实为材料,利用qRT-PCR技术检测17个看家基因的表达水平,借助ge Norm和Norm Finder筛选出果实发育期理想的内参基因。[结果]Ge Norm评估YLS8和ACT并列排名第一,表达稳定值均为0. 221,配对差异值V2/3为0. 105; Norm Finder排名前两名为TBP2和YLS8,表达稳定值为0. 160和0. 191。使用内参基因YLS8和TBP2分析火龙果甜菜色素合成途径关键基因HpCytP450-like1的表达水平,与基因Hp Cyt P450-like1在火龙果果实发育期表达趋势一致。[结论]从17个候选基因中筛选出2个理想的的内参基因YLS8和TBP2,可作为火龙果果实发育期相关基因的表达调控研究。

试栽羊肚菌分子系统分析下载：76 浏览：502

兰阿峰1,2 李勃1 郭素芬1 彭浩1,2 刘璐1,2 邓百万1,2 《生物技术研究》 2019年2期

摘要:

为了弄清陕西汉中试栽羊肚菌的种类归属。[方法]收集到汉中地区试栽羊肚菌子实体19个样品,采用CTAB法提取其基因组DNA,使用通用引物PCR扩增5个基因序列(ITS、LSU、EF1-α、RPB1和RPB2)保守区片段,用1. 0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测,并对PCR产物送样测序。依据测序结果构建系统发育树,结合系统发育树进行物种归属鉴定。[结果]获取了所有样品的5个基因序列保守区片段,通过测序比对19个样品5个基因序列保守区片段并进行序列联合,对总长度3 025 bp的保守区序列分析并构建系统发育树,依据系统发育树鉴定出汉中试栽羊肚菌分别为六妹羊肚菌(Morchella sextelata)、梯棱羊肚菌(M. importuna)、隐形羊肚菌(M. cryptica)和北方羊肚菌(M. septentrionalis)。[结论]采用多基因联合分析法弄清楚汉中试栽羊肚菌的种类归属。

基于CRISPR/Cas9技术的HaCaT的TLR4基因定向敲除及其功能初步研究下载：87 浏览：496

黄瑜烨1 李碧舟1 何颖2 孟繁梅1 邹泽红2 陶爱林2 艾云灿1 《生物技术研究》 2019年1期

摘要:

构建敲除Toll Like Receptor 4(TLR4)基因的Ha Ca T细胞株,为后续利用该细胞株进行过敏原性研究提供材料。[方法]利用CRISPR/Cas9系统,根据靶向原理设计并合成4条特异性识别TLR4基因的向导RNA(single-molecule guide RNAs,sgRNAs),构建p X459-sgRNAh TLR4重组质粒,并转入Ha Ca T中,用嘌呤霉素筛选出单克隆阳性细胞。测序确认突变位点,然后利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激对TLR4进行功能验证来进一步确认敲除效果。[结果]测序结果表明#26单克隆细胞株在靶点附近缺失1 bp,造成TLR4编码基因的移码突变,蛋白翻译提前终止。功能性验证结果表明,在LPS的刺激下,IL-8和CCL20的mRNA水平分别下降约85%和90%,且IL-8的蛋白分泌水平也显著性下调(87%)。[结论]成功构建了敲除TLR4的稳定细胞株,并且验证TLR4的功能缺损。

拟南芥肌醇半乳糖苷合成酶与棉子糖合成酶的体外催化活性比较下载：82 浏览：21

郑小芬李晓霞黄金兰余方回刘妙玲范芳黄迎娣张玲周英彪《生物技术研究》 2019年1期

摘要:

基因克隆及原核表达纯化后比较拟南芥的2个肌醇半乳糖苷合成酶及2个棉子糖合成酶的体外催化活性,为微生物法或酶法合成棉子糖尊定基础。[方法]RT-PCR克隆拟南芥的肌醇半乳糖苷合成酶(GolS1及GolS3)与棉子糖合成酶(RafS1及RafS5)的基因,分别构建原核表达菌株,诱导表达纯化获得酶,电泳检测及蛋白定量后进行体外酶催化反应,HPLC分析产物。[结果]克隆到GolS1与GolS3及RafS1与RafS5的基因,原核表纯化获得纯酶,以反应体系中目标产物生成速率衡量,GolS1与GolS3催化速率分别为0.51和0.28mmol/(mg·min),RafS1与RafS5的催化速率分别为0.45和0.21mmol/(mg·min)。[结论]拟南芥的肌醇半乳糖苷合成酶(GolS1及GolS3)与棉子糖合成酶(RafS1及RafS5)基因经异源表达后具有良好酶活,其中GolS1酶活是GolS3的1.82倍,RafS1酶活是RafS5的2.14倍。

LIN28A在GT1-7细胞中过表达对性发育相关基因的影响下载：84 浏览：494

范雅婷王欣孙贤丽肖君华李凯周宇荀《生物技术研究》 2019年1期

摘要:

在GT1-7细胞过表达LIN28A,研究其与性发育相关基因表达是否存在调控关系; RNA-seq发现LIN28A参与调控性发育的信号通路和基因。[方法]构建LIN28A慢病毒过表达载体,转染GT1-7细胞,Real-Time PCR检测LIN28A和性发育相关基因在mRNA水平表达变化;将过表达LIN28A的GT1-7细胞进行RNA-seq、生物信息学分析、Real-Time PCR验证,找到影响性发育的信号通路和基因。[结果]与对照相比,LIN28A在GT1-7细胞过表达18倍(P <0. 001),KISS1在mRNA水平显著升高(P <0. 01); KEGG分析,LIN28A相关的差异基因在MAPK信号通路差异显著,MAPK通路筛选到多个性发育相关基因(Fgf21、JUN、Cyp1a1、Rasgrp2),Real-Time PCR验证它们在mRNA水平差异显著(P <0. 05)。[结论]成功构建LIN28A慢病毒过表达载体,LIN28A在GT1-7细胞中过表达会促进KISS1的表达,并且LIN28A可能通过MAPK通路调控性发育。

文化基因视角下的多巴“河湟文心”片区规划设计研究下载：21 浏览：226

王振茂杨一帆郝爽邓龙《中国城镇》 2019年3期

摘要:

城市文化基因决定着城市的外在形象和内在气质,延续和传承城市的本土优秀文化基因越来越引起人们的关注和讨论。文章通过对青海省西宁市湟中县多巴镇"河湟文心"片区的深入研究和挖掘,提炼出代表其本土特色的六个文化基因,其中显性基因包括高原山城文化基因、河谷水岸文化基因、商贸驿道文化基因、田园沟渠文化基因和庄廓建筑文化基因,而隐性基因主要为多元民族文化基因。在此基础上通过采取山城掩映的空间结构、水城相依的生态水岸、尺度宜人的十字商街、蓝绿交织的特色水街、庄廓演绎的建筑风貌五大策略来对显性基因进行空间强化,并提出隐性基因传承发展的策略建议,力求使多巴的本土优秀文化基因得以体现和传承,进而形成一个特色的、有个性的活力片区。

尾叶桉GLU4无性系F5H基因的克隆表达及序列分析下载：82 浏览：493

肖玉菲1 刘海龙1 刘雄盛1 晏巢2 陈博雯1 《生物技术研究》 2018年11期

摘要:

克隆尾叶桉(Eucalyptus urophylla)GLU4中F5H基因全长,并对其进行序列和表达模式分析。[方法]根据NCBI公布的F5H基因保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4茎部组织为试验材料克隆其g DNA和c DNA片段,利用荧光定量PCR分析其在植株不同组织中的表达模式。[结果]该基因g DNA长2 358 bp,c DNA长1 610 bp,含有2个外显子、1个内含子。开放阅读框编码529个氨基酸,Eu F5H编码的蛋白为一个带负电荷、存在跨膜结构、定位在内质网起始分泌途径中的蛋白质,二级结构包含典型的的α-螺旋和β-折叠,根据三级结构推测其可能具有羟化酶活性。Eu F5H蛋白与蓝桉亲缘关系较近,Eu F5H在不同组织中表达水平差异显著,其中半木质化茎中表达水平相对最高。[结论]成功获得了尾叶桉GLU4木质素合成酶基因F5H的全长序列。

苍白杆菌核糖-5-磷酸异构酶B基因的克隆及表达下载：84 浏览：485

沈敏姚雪梅张孝峰李良智胡翠英鞠鑫《生物技术研究》 2018年10期

摘要:

将新筛选出的苍白杆菌菌株中的核糖-5-磷酸异构酶B(Rpi B)克隆到大肠杆菌中进行异源表达优化。[方法]以苍白杆菌菌株基因组为模板PCR扩增Rpi B基因,经酶切连接表达载体p ET-28a后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE分析表达情况。通过LC-MS-MS验证重组酶活性。[结果]SDS-PAGE分析表明,核糖-5-磷酸酶在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白,分子量在19 k Da左右。优化结果表明在16℃下需要IPTG诱导20 h后蛋白表达量最多。重组粗酶液在30℃下转化L-鼠李糖为L-鼠李酮糖,转化率为19%。[结论]成功克隆并表达出来源于苍白杆菌的Rpi B酶,它对其非天然底物糖L-鼠李糖表现出了异构酶活性。

细胞增殖相关基因Nek2的表达与宫颈癌发生的相关性研究下载：81 浏览：489

玛伊热·努尔艾合麦提1 宋丹1 彭瑞娟1阿木提喀日·马木提1 玛依努尔·尼牙孜2 马正海1 《生物技术研究》 2018年10期

摘要:

探究细胞增殖过程中中心体分离相关基因Nek2(NIMA-related kinase 2,Nek2)的表达水平以及抑制Nek2对宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力的影响。[方法]采集未经放疗或化疗的正常宫颈组织50例,宫颈癌组织40例,提取标本组织总RNA,实时荧光定量PCR检测Nek2在病样组织中的表达水平,以正常宫颈组织作为对照分析Nek2与宫颈癌发生的相关性。以Nek2 siRNA转染Si Ha、He La和293FT(对照)细胞,CCK-8细胞增殖检测法分析细胞数量和对细胞增殖的抑制率,Transwell小室侵袭和Transwell迁移实验检测细胞侵袭和迁移能力。[结果]Nek2 mRNA在宫颈癌的相对拷贝数(0.0119±0.00601)极显著高于(P<0.01)正常宫颈组织(0.00133±0.00216),上调8.94倍。抑制Nek2的活性可显著抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05),且抑制率显著高于非肿瘤细胞的抑制率。[结论]Nek2在宫颈癌组织中的表达水平显著提高,其通过促进癌细胞增殖、侵袭和迁移来促进肿瘤的发生,可作为宫颈癌治疗的候选靶标。

球磨-CTAB法提取嗜酸乳杆菌基因组DNA条件优化下载：82 浏览：494

臧凯丽1 王泳1 赵林森2 闫亚丽1 崔文静2 马新颖2 赵培1 陈庆森1 《生物技术研究》 2018年10期

摘要:

以嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为试验菌株,寻找一种高质量、高稳定性的细菌基因组DNA的提取方法。[方法]采用球磨-十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)法提取细菌基因组DNA,通过调整研磨珠直径、菌体量、破碎时间三因素对DNA提取效果进行正交优化。[结果]确定最佳优化条件为破碎时间3.5 min、菌体量9×10～8CFU/m L、研磨珠直径0.1 mm。[结论]经条件优化后的球磨-CTAB法短时间内可获得高质量的细菌DNA产品,处理量大、方便快捷。

PKM2对乳腺癌细胞有氧糖酵解、增殖和凋亡的影响下载：82 浏览：499

姚奥范丽娟黄凤张慧敏戴周彤张子健李慧杜庆项园廖兴华《生物技术研究》 2018年8期

摘要:

探讨siRNA介导的PKM2基因沉默对乳腺癌细胞中有氧糖酵解、细胞增殖和凋亡产生的影响。[方法]荧光定量PCR检测乳腺癌细胞转染siRNA-PKM2的效率,葡萄糖和乳酸试剂盒及Western Blot检测细胞的糖酵解能力,CCK-8法检测细胞增殖能力,Western Blot检测细胞的凋亡状况。[结果]与对照组相比,转染PKM2的siRNA 48h后,细胞摄取葡萄糖量及乳酸分泌量均明显降低(P<0.05),两种与糖酵解相关的蛋白Glut1和PFK-1表达量均降低;细胞增殖速率减慢(P<0.05);抗凋亡蛋白bcl-x L蛋白表达降低,促凋亡蛋白caspase-9蛋白表达增多。[结论]siRNA介导的PKM2基因沉默能抑制乳腺癌细胞的有氧糖酵解及增殖能力,并促进细胞凋亡。

缺铁应答基因FOX1上游调控基因的筛选下载：81 浏览：500

李亚军1 费小雯2 邓晓东1 《生物技术研究》 2018年7期

摘要:

筛选与莱茵衣藻FOX1基因启动子结合的调控基因序列。[方法]利用酵母单杂交的方法,构建pHIS2.1-FOX1诱饵载体,并将其转入到酵母菌株Y187中,在SD/-Trp/-His/-Leu/50 mmol/L 3-AT筛选培养基上挑选酵母阳性转化子,PCR克隆阳性转化子的序列并测序,利用Blastx程序检索phytozome莱茵衣藻基因组数据库,获得阳性转化子序列的同源基因信息。[结果]18个酵母阳性转化子测序成功,其同源基因主要有CTR型铜离子转运体(CTR2)、核糖体蛋白,和参与光合作用、氧化还原反应和物质运输等方面的功能蛋白。[结论]利用酵母单杂交技术筛选到缺铁应答基因FOX1潜在的上游调控基因。

苏云金芽胞杆菌cyt2Ba16基因的克隆表达下载：481 浏览：495

关鹏1 秦培钢2 代小娟1 宋金东1 《生物技术研究》 2018年7期

摘要:

获得苏云金芽胞杆菌QL32-1中杀虫晶体蛋白基因,并分析其杀虫活性。[方法]采用cyt基因通用引物、两步法染色体步移的方法对QL32-1中cyt基因进行鉴定和全长克隆,再构建重组质粒pET-28a-2Ba16,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,最后对表达蛋白进行杀虫活性分析。[结果]克隆得到1个全长783 bp cyt2B基因,其编码260个氨基酸,推导分子量约29.69 kDa,此氨基酸序列与已知的Cyt2Ba1蛋白同源性最高,为92.4%。该基因被国际杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cyt2Ba16。杀虫活性分析表明:cyt2Ba16对双翅目的库蚊(Culex quinquefasciatus)具有显著的杀虫活性,LC50为9.73μg/mL。[结论]cyt2Ba16基因是一个对库蚊具有较高杀虫活性的新型cyt基因,为QL32-1菌株的应用提供理论基础。

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