目的通过构建乙肝病毒（HBV）重组质粒来制备共价闭合环状DNA（cccDNA）,为cccDNA定量检测提供合适的标准品。方法选择本院就诊的2名慢性乙肝患者,采取蛋白酶K消化法提取其血清病毒DNA,运用高保真聚合酶扩增HBV DNA,然后将扩增片段插入克隆载体构建HBV重组质粒。以重组质粒为模板制备环状DNA,经测序鉴定和PCR定量检测。结果 HBV DNA全长序列被成功扩增,并顺利构建重组质粒。2个重组质粒经内切酶消化均能得到预期的HBV DNA片段（约3.2 kb）和载体DNA片段（约2.7 kb）;经测序鉴定,2个质粒分别为HBV B和C基因型,其插入序列保真性好,错配率低,每kb分别为1.24 bp和1.56 bp;以重组质粒为模板制备的2个环状DNA长度均约为2.1 kb,测序证实为HBV cccDNA;经定量检测,其纯度高,浓度分别为1.05×1010IU/ml和6.19×10～9IU/ml。结论利用重组质粒方式制备的HBV cccDNA具有纯度高、获取量大等优点,可作为cccDNA定量检测和方法性能验证的标准品。