高效液相色谱法是一种比较常用的药物成分测定方法，由于其较高的准确度以及适用范围广泛等诸多优势，受到人们的广泛青睐。以下本文主要以养阴清肺颗粒中药复方制剂为研究对象，采取高效液相色谱法，对其中的有效成分含量测定方法进行了试验。目前我国对该中药复方制剂的成分含量测定主要集中在芍药苷和甘草苷两个单成分方面，质量检验标准不够完善，因此，对相关测定方法进行优化十分有必要。
1仪器与试剂
本次试验所用仪器如下：Agilent Technologies 1200 Series 高效液相色谱仪； UVmini-1240 型紫外可见分光光度计； AUY220 电子分析天平； KQ-250B 型超
声波清洗器。所用试药包括：芍药苷、 甘草苷和肉桂酸对照品均购自中国食品药品检定研究院；养阴清肺颗粒(批号20130201、121206034、130101)。甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为双重蒸馏。
2色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAXSB-C 18(250 mm×4.6 mm，5µm)；流动相：0.2％磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0-4 min，18%B→18%B，4-9 min，18%B→37%B，9-16 min，37%B→37%B；波长切换：0-6.3 min，276 nm，6.3-7.3 min，230 nm，7.3-16 min，276 nm；流速：1.0 mL·min-1，柱温：28℃，进样量：20µL。结果表明芍药苷、甘草苷、肉桂酸分离度良好，且样品中的其他成分不干扰测定。
3试验过程
3.1对照品溶液制备
分别精密称量芍药苷、 甘草苷和肉桂酸对照品适量，并单独装到等体积容量瓶中，量瓶容积为25ml。加入甲醇溶液进行定容，三份溶液的定容是浓度依次为 296、427 和 220 µg·mL −1 ，作为储备溶液使用。然后分别量取三种储备溶液1.0ml、0.5ml和0.2ml，装入新的25ml容积量瓶当中，继续以甲醇溶液定容，获得11.84、8.54和1.76 µg·mL −1 的对照品溶液。
3.2供试品溶液制备
将事先准备好的养阴清肺颗粒放置于研钵内研成细粉末，称取研磨后的粉末0.25g 放到 100 mL 具塞锥形瓶中，加入浓度为50%的甲醇溶液25ml进行溶解并称定重量，然后将其置于超声下提取60分钟。结束后自然冷却，减少的重量部分再次加入甲醇溶液进行补足，收集上清液置于 0.45 µm 滤膜上进行过滤即可获得。
3.3 方法学考察
3.3.1 线性关系考察
本次试验按照上述色谱条件，分别精密吸取混合对照品储备液(I)0.5、1.0、2.0，5.0、10.0 mL，分装至容积为25 mL的量瓶内，通过甲醇溶液进行稀释，获得对照品混合溶液。量取该混合溶液各20μL，分别注入色谱仪，以色谱峰面积Y对对照品浓度X(µg·mL-1)进行线性拟合计算。结果表明，芍药苷在0.2368-4.736µg·mL-1，甘草苷在0.1708-3.416µg·mL-1，肉桂酸在0.0352-0.704µg·mL-1线性关系良好。
3.3.2精密度试验
按照上述色谱条件，精密吸取供试品溶液20µL，重复进样6次，结果如表1所示，表明仪器精密度良好。
3.3.3稳定性试验
按照上述色谱条件，精密吸取同一供试品溶液20µL，分别在0，2，4，6，8，10 h进样，测得峰面积的RSD结果如表2，表明供试品溶液在10 h内稳定。
3.3.4重复性试验
取同一批号（批号121206034）样品，按“3.2”项方法平行制备供试品溶液6份，在上述色谱条件下分别进样20µL。得峰面积RSD数据见表3，表明本方法重复性良好。
4提取方法选择
4.1提取溶剂的选择
精密称定样品0.25 g，固定其它萃取条件：料液比1:30，提取总时间60 min，分别用10%，30%，50%，70%，90%，100%甲醇进行萃取，考察提取溶剂对芍药苷、甘草苷和肉桂酸提取率的影响，三组分提取率随甲醇浓度的增加，变化趋势基本一致，在甲醇浓度达到50%时均达到最大，之后随甲醇浓度的增加，提取率呈下降趋势，故选取甲醇浓度为50%作为下一阶段单因素优化时的参考值。
4.2提取时间的选择
精密称定样品0.25 g，固定其它萃取条件：料液比1:30，萃取溶剂50%甲醇，分别提取10，20，40，60，80，100 min，考察提取时间对芍药苷、甘草苷和肉桂酸提取率的影响。在前60 min三组分提取率随提取时间的增加呈上升趋势，当超声时间增加到60 min后，肉桂酸提取率明显下降。因此，将60 min作为下一阶段单因素优化时的参考值。
4.3料液比的选择
精密称定样品0.25 g，固定其它萃取条件：甲醇浓度50%，提取总时间60 min，分别用液料比：1:20，1:40，1:60，1:80，1:100，1:120进行萃取，考察料液比对芍药苷、甘草苷和肉桂酸提取率的影响。甘草苷变化趋势不显著，但芍药苷在料液比为1:60时有最大值，综合考虑，所以选取料液比为1:60作为单因素优化时的参考值。
5讨论
通过本次试验充分证明，高效液相色谱法检测中药复方制剂有效成分含量的方法具有可行性，在使用50%甲醇作提取剂，以1:60为料液比，超声提取60 min的条件下，中药制剂提取效率最高。所检测中药成分均达到药物检测要求，可以被广泛用于同类产品的质量检验。测定结果发现，不同批次的药物，其有效成分质量存在一定差异性，证明部分药厂生产工艺有待改进，通过高效液相色谱法可以进行辅助筛选改进批次。
参考文献
[1] 张咪咪. 高效液相色谱法在中药复方制剂有效成分含量测定的应用研究[D]. 延安大学, 2015.
[2] 孙楠. 高效液相色谱法在中药复方制剂妇炎康有效成分含量测定的应用研究[J]. 临床医药文献电子杂志, 2017, 28(v.39;No.187):164-165.
[3] 叶敏. 信息化背景下中药复方制剂有效成分含量测定高效液相色谱法的应用[J]. 科学与信息化, 2017(33):2.
[4] 邱盼子, 肖作奇, 黄涛,等. 高效液相色谱法同时测定时行感冒1号方合剂中6种有效成分含量[J]. 中国医药导报, 2020, 17(33):4.
