1.1项目背景
肿瘤是一种全球性的恶性疾病,发病率逐年上升,死亡率高,严重影响人们的身体健康和生活质量。全球每年有138万肺癌新增病例和超过100多万人死于肺癌。其中，非小细胞肺癌(non-small cell lungcaneerNSCLC)占肺癌的80%~85%，其5年生存率不到15%。NSCLC患者中约30%的患者在诊断时就已发生远处转移。50%-60%的患者在治疗过程中发生远处转移并且最终80%~90%的患者都死于肺癌的转移。因此，抑制和预防肺癌细胞转移是治疗NSCLC 和提高患者生存率的关键。肿瘤转移受多因素、多步骤调控主要包括肿瘤细胞间黏附力降低，而与细胞外基质(extracel- lular matrix.ECM)黏附力增强、降解ECM和基底膜、肿瘤细胞迁移、侵袭能力的增强，从而进入血流或淋巴系统.最终到达靶器官形成新的肿瘤生长。因此,抑制NSCLC细胞黏附、侵袭和迁移是抑制其转移的基础。桔梗来源于桔梗科植物桔梗的干燥根，在中医学中，具有宣肺，利咽，祛痰，排脓的功效，是中医临床上常用的化痰药，也是药食两用的中药之一。现代研究表明，桔梗的主要活性物质桔梗皂苷具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗血栓、抗癌、调节免疫等多种药理作用桔梗在临床上常用于治疗肺部和呼吸系统疾病。桔梗皂苷被认为是桔梗的主要有效成分,其抗肿瘤活性显著,作用机制涉及抑制肿瘤细胞增殖和病理性血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡和自噬、抑制肿瘤细胞迁移、黏附、侵袭等;此外还具有调节免疫、抗炎、保肝、抗动脉粥样硬化等作用。药动学研究显示,桔梗皂苷的口服生物利用度较差,体内代谢受肠道菌群和配伍影响。临床上以桔梗为主药组成的方剂治疗呼吸系统疾病和肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤均有较好疗效。本实验旨在探究桔梗皂苷-D(platycodin-D,PD)抑制肺癌细胞增值。
1.2国内外研究现状
桔梗为桔梗科植物，桔梗Platycodon grandiflorum (Jacq.) 作为为常用中药，资源丰富，在我国有悠久的临床应用历史。桔梗性味苦、辛、平，归肺经，具有宣肺、利咽、祛痰、排脓之功效。研究表明，桔梗含有三萜皂苷、多糖、黄酮、聚炔、甾体、酚酸、脂肪酸等类型的化合物，主要活性成分为五环三萜类双糖链皂苷，包括桔梗皂苷A、C、D、D2、D3、E，其中桔梗皂苷D是从中药桔梗中提取分离的三萜类皂苷，并且是使用最广泛的主要活性物质。桔梗作为一种传统草药，在东北亚地区（包括中国，日本和韩国）被广泛应用于治疗咳嗽，过量的痰和咽喉的其他疾病（中华人民共和国药典委员会，2005）。此外，桔梗也对心血管和代谢系统表现出显着的影响。近几十年来，桔梗的研究主要集中在其抗肿瘤，肝保护，肾保护，免疫调节和抗氧化效应等生物活性。
对肿瘤细胞的增殖影响，代氏等的研究发现，PD对肺腺癌细胞植株A549和白血病细胞K562增值有抑制作用。肿瘤细胞半数抑制率研究显示，PD对肺癌，肝癌，胃癌，结肠癌，乳腺癌，和宫颈癌等多种肿瘤细胞的增值都有抑制作用。
国外近年对桔梗的研究主要集中在药理方面，韩国学者桔梗皂苷和多糖类成分进行了大量的研究，发现多糖能激活促细胞分裂蛋白酶活性。日本学者将桔梗的提取物用于化妆品和浴液中。经研究表明桔梗中的提取物可以抑制黏多糖的降解，消除自由基，具有抗氧化作用，可用于抗衰老的化妆品。
2.1基本思路
通过查阅文献得知，如今肺癌仍不能得到有效治疗和预防。我们项目组了解到桔梗皂苷-D具有抗炎、止痛、抗肿瘤等作用，刚好对肺癌的治疗和预防有一定有效帮助。为了研究桔梗皂苷-D对肺癌细胞增殖的抑制作用，通过醇提取法对桔梗的有效成分进行提取，得到桔梗皂苷-D，并对完成建模的小鼠进行分组实验，在此之前通过传代培养法，培养出H1299细胞株系，并建立NGS裸鼠模型。将小鼠分为四组，一组正常对照，其余三组用桔梗皂苷-D进行灌胃处理，用药量分别为低、中、高三挡。实验过程中，不断观察小鼠状态，对小鼠干预三周后，在最后对小鼠进行取材、称瘤重、计算折瘤率。由实验结果得出桔梗皂苷-D对肺癌细胞增殖的影响。
2.2主要观点
2.2.1桔梗的药理作用
经考证，桔梗的药性从东汉时期开始至今，由单药味“辛”转向复合药味“苦、辛”及归经从“手太阴”“手少阴”“足阳明胃”到“入肺，兼入心、胃”再到“入肺经”的不同看法；桔梗的功能主治古今取舍不同，历代本草归纳总结出来桔梗诸多具有研究价值的潜在功用。现代研究表明桔梗在镇咳祛痰、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗糖尿病、抗肥胖、保肝、免疫调节等方面有显著药理活性。桔梗有效提取物---桔梗皂苷-D，桔梗皂苷D(platycodin-D,PD)是从中药桔梗中分离提取的一种三萜类单体,是桔梗科植物桔梗的主要有效成分,具有抗炎、降血糖血脂、抗肿瘤及免疫调节和抗过敏等多种药理作用;此外,还对皮肤癌、人白血病、卵巢癌、乳腺癌和大肠癌等多种肿瘤细胞具有杀伤作用。
2.2.2实验科学性
非小细胞肺癌(non-small cell lungcaneerNSCLC)占肺癌的80%~85%，其5年生存率不到15%。并且80%~90%的肺癌患者都死于肺癌细胞的转移，桔梗皂苷-D具有消炎止痛、抗肿瘤的作用。在一定程度上抑制肺癌非小细胞的增殖，延长患者生命期限，减少治疗过程中的痛苦。实验设置四组进行对照实验，实验具有准确性，实验结果可靠。
3.1研究方法
3.1.1桔梗皂苷-D试剂的提取与分离
（1）实验材料：桔梗、70%甲醇、大孔树脂D101柱色谱、硅胶柱色谱、高效液相色谱、40%乙醇、氯仿。
（2）实验过程：桔梗生药用70%甲醇提取,浓缩后经大孔树脂D101柱色谱,40%乙醇洗脱组分用硅胶柱色谱分离,以氯仿-甲醇系统梯度洗脱,收集含桔梗皂苷D的组分,最后经高效液相色谱制备纯化。并将提取出的桔梗皂苷-D分别制备成低浓度和高浓度的桔梗皂苷-D试剂。
3.1.2动物实验设计
实验材料：肺癌患者H1299细胞、肺癌细胞培养皿、NSG裸鼠、生理盐水、低剂量桔梗皂苷-D试剂、高剂量桔梗皂苷-D试剂、细胞取样器、低速离心机、显微镜、载玻片、手术刀、乙醚、镊子。
患者癌细胞及NSG裸鼠处理
1.H1299细胞株系的培养
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL*培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
贴壁细胞传代：弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次；加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的*培养基终止消化。轻轻吹打细胞，脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
悬浮细胞传代：收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。
2.建立NSG裸鼠模型
将H1299细胞株系(2x106个/只)右背侧近腋部皮下接种于6~8周龄SPF级雄性NOD/SCID小鼠体内，随后切除首代小鼠移植瘤，收集肺转移灶肿瘤细胞，从第二代起采用肺转移灶-皮下移植-肺转移灶-皮下移植的体内循环筛选方法传代，第4代NOD/SCID小鼠在接种后12周肺转移率100%，建立NSG裸鼠模型。
3.NSG裸鼠模型分组
将60只小鼠提前给予普通饲料和无菌水饲养一周，适应环境。随机分成4组，每组15只。将建立的人非小细胞肺癌荷瘤动物模型的NSG裸鼠分为四组：正常对照组、低桔梗皂苷-D剂量组、中桔梗皂苷-D剂量组、高桔梗皂苷-D剂量组。此后三周内每天，低、中、高组剂量分别以1.0、3.0、6.0g/kg的桔梗皂苷-D灌胃，正常对照组则用生理盐水等体积灌胃。
4.实验结果及分析
实验干预三周后分别对三组小鼠进行取材、称瘤重、计算折瘤率。实验结果应为高桔梗皂苷-D试剂干预的一组折瘤率大于中、低、桔梗皂苷-D试剂干预的一组，而用生理盐水干预的一组小鼠应尽数死亡。
4.1成果形式
经济成果：基于桔梗皂苷D具有抗肿瘤、消炎止痛、宣肺平喘等功效，我们将进一步更深层次的研发出相关日常生活中的药物，方便人们在日常生活中进行更好的选择，帮助大家减轻病痛影响，达到对症治疗的功效。且该品价格定位亲民，在功效上尤为突出，拥有广阔市场，具有很好的经济效益。
4.2成果价值
4.2.1学术成果说明：目前研究有效防治肺癌以及减轻肺癌治疗过程中痛苦的探究具有一定空缺，通过创新型实验即桔梗提取液对小鼠肺癌细胞在体内增殖抑制作用的探究，以及最后得出的桔梗提取液对小鼠肺癌细胞的增殖具有一定抑制作用的结论。因此为有效防治及减轻肺癌治疗过程痛苦填补空白。
4.2.2经济成果说明：
本实验通过创新型实验对桔梗的有效药理成分进行提取，得到桔梗皂苷-D提取液后对完成建模的小鼠进行实验研究，最后得出了桔梗皂苷-D有效抑制了肺癌细胞的增殖的结论。因此，可以利用桔梗皂苷-D提取液研究开发出相关药品。如在给接受痛苦化疗的肺癌患者减少一点痛苦，同时抑制其体内的肺癌细胞增殖，延长病人的生存期限，为医生的抢救保留时间。让早期肺癌患者有更长时间可以进行保守治疗，留给医生更多的时间设计更好的治疗方案。其消炎止痛、宣肺平喘等功效能更好的运用到人们的生活中，帮助解决生活中身体出现的小毛病，保护好人体器官肺，且桔梗皂苷-D的药用价值高，成本低，即性价比高，价格亲民，市场潜力大，可以得到很好的推广。
5、研究项目有何创新、有何特点。
（1）我们实验逻辑思维清晰，目标明确，相关信息掌握的较全面、准确。同时具有科学的预测性和正确途径，利用多组对照实验，保证实验结果的准确性、严谨性和可信性。并且我们实验方案齐全，多方面发现问题并反馈，能够及时解决问题，减少实验误差。
（2）我们小组分工明确，遇到新问题可以及时解决。我们小组通过利用NOD/SCID小鼠建立NSG裸鼠模型组，该小鼠为度免疫缺陷程度小鼠，各种肿瘤细胞可以植入，且较少发生排斥反应及移植物抗宿主病（graft-versus-host, GVHD）。更加利于H1299细胞株系的植入，提高小鼠模型建立的成功率，减少小鼠副反应的发生，使实验过程分析更加简洁，增加实验结论的可信性。
主要参考文献。
[1]代群，陈哲，葛宇清，等，桔梗皂苷-D诱导人肺癌细胞A549的凋亡及机制[J].中国中药杂志，2012,37(17):2626-2629.
[2]代群，葛宇清，王海兵，等，桔梗皂苷D抑制人白血病细胞株K526的增殖和诱导凋亡的作用[J].浙江中医杂志，2011,46(12):911-913.
[3]王思宇,王宇.桔梗皂苷D在抗肿瘤作用机制中的研究进展[J].世界科学技术-中医药现代化,2021,23(09):3226-3234.
[4]马琳琳,杨新鸣,时思毛等.桔梗皂苷D抗肿瘤作用机制研究进展[J/OL].中医药信息,2022(04):72-78[2023-05-01].https://doi.org/10.19656/j.cnki.1002-2406.20230412.
[5]赵若琳,周坤福,张旭等.桔梗皂苷-D抑制非小细胞肺癌H460和A549细胞黏附、侵袭和迁移的作用机制研究[J].中国药理学通报,2015,31(02):241-247.
作者简介:
陈婷(2004-)，女，汉族，江西省新余市，本科在读，研究方向为医药类。
付雨欣（2003-），女，汉族，河北省秦皇岛市，本科在读，研究方向为医药类。
马秀丽（2004-），女，汉族，辽宁省阜新市，本科在读，研究方向为医药类。
张梓函（2004-），女，汉族，河北省唐山市，本科在读，研究方向为医药类。
姜欣铭（2004-），女，汉族，黑龙江省哈尔滨市，本科在读，研究方向为医学类。
