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苍白杆菌核糖-5-磷酸异构酶B基因的克隆及表达 下载：84 浏览：503
摘要:
将新筛选出的苍白杆菌菌株中的核糖-5-磷酸异构酶B(Rpi B)克隆到大肠杆菌中进行异源表达优化。[方法]以苍白杆菌菌株基因组为模板PCR扩增Rpi B基因,经酶切连接表达载体p ET-28a后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE分析表达情况。通过LC-MS-MS验证重组酶活性。[结果]SDS-PAGE分析表明,核糖-5-磷酸酶在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白,分子量在19 k Da左右。优化结果表明在16℃下需要IPTG诱导20 h后蛋白表达量最多。重组粗酶液在30℃下转化L-鼠李糖为L-鼠李酮糖,转化率为19%。[结论]成功克隆并表达出来源于苍白杆菌的Rpi B酶,它对其非天然底物糖L-鼠李糖表现出了异构酶活性。
假单胞菌甲苯双加氧酶在手性亚砜合成中的活性分析 下载：84 浏览：498
摘要:
从蒙氏假单胞菌CCTCC M2013683中克隆出甲苯双加氧酶基因,通过基因克隆与重组表达,获得重组酶,初步探讨其在手性亚砜合成中的活性。[方法]利用基因克隆技术获得甲苯双加氧酶基因的重组质粒,通过热激法转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行可溶性蛋白的诱导表达,用SDS-PAGE凝胶电泳检测可溶性蛋白的表达情况。将表达有重组蛋白的整细胞作为催化剂,催化氧化苯甲硫醚,用气相色谱检测苯甲亚砜的产率。[结果]基因tod-c1和基因tod-c2成功地连接在了p ETDUET-1载体上,重组表达菌株表达出了大量可溶性蛋白(Tod-C1/C2)。甲苯双加氧酶催化氧化2 mmol/L苯甲硫醚底物,最终得到了产率为0.6%的苯甲亚砜。[结论]获得了甲苯双加氧酶重组蛋白,并应用该蛋白催化获得了产率为0.6%的苯甲亚砜。
小鼠Prune蛋白DHH结构域的原核表达及多克隆抗体的制备 下载：75 浏览：510
摘要:
表达、纯化小鼠Prune蛋白DHH结构域(m-Prune D),并制备多克隆抗体。[方法]生物信息学方法分析m-Prune D氨基酸序列;PCR扩增目的基因m-Prune D,克隆入原核表达载体p ET28a(+);IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白表达,亲和层析法纯化蛋白;用纯化的重组m-Prune D免疫小鼠制备多克隆抗体;Western Blot检测多克隆抗体特异性。[结果]PCR成功扩增m-Prune D基因,双酶切及测序结果表明成功构建m-Prune D原核表达载体,SDS-PAGE和Western Blot鉴定表明成功表达约25 k Da的重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠后抗体滴度最高可达1∶25 600,所制备的多克隆抗体可特异性识别原核和真核细胞中DHH结构域蛋白。[结论]在E.coli中成功表达小鼠Prune蛋白DHH结构域,制备了多克隆抗体血清,可用于Prune蛋白生物学功能的进一步研究。
细胞增殖相关基因Nek2的表达与宫颈癌发生的相关性研究 下载：81 浏览：500
摘要:
探究细胞增殖过程中中心体分离相关基因Nek2(NIMA-related kinase 2,Nek2)的表达水平以及抑制Nek2对宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力的影响。[方法]采集未经放疗或化疗的正常宫颈组织50例,宫颈癌组织40例,提取标本组织总RNA,实时荧光定量PCR检测Nek2在病样组织中的表达水平,以正常宫颈组织作为对照分析Nek2与宫颈癌发生的相关性。以Nek2 siRNA转染Si Ha、He La和293FT(对照)细胞,CCK-8细胞增殖检测法分析细胞数量和对细胞增殖的抑制率,Transwell小室侵袭和Transwell迁移实验检测细胞侵袭和迁移能力。[结果]Nek2 mRNA在宫颈癌的相对拷贝数(0.0119±0.00601)极显著高于(P<0.01)正常宫颈组织(0.00133±0.00216),上调8.94倍。抑制Nek2的活性可显著抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05),且抑制率显著高于非肿瘤细胞的抑制率。[结论]Nek2在宫颈癌组织中的表达水平显著提高,其通过促进癌细胞增殖、侵袭和迁移来促进肿瘤的发生,可作为宫颈癌治疗的候选靶标。
球磨-CTAB法提取嗜酸乳杆菌基因组DNA条件优化 下载：82 浏览：507
