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东方肉座菌EU7-22纤维素内切酶Ⅰ的异源表达 下载：78 浏览：505
摘要:
实现东方肉座菌纤维素内切酶EGⅠ在毕赤酵母中的表达,获得重组EGⅠ。[方法]通过RT-PCR获得EGⅠ开放阅读框。将EGⅠ成熟肽和PHO1信号肽的DNA片段插入p PIC3. 5K后,重组表达载体电转化毕赤酵母。通过甲醇诱导表达和镍柱纯化获得EGⅠ。以羟甲基纤维素钠检测活性,以肽N-糖苷酶F分析N-糖基化,以SDSPAGE分析表达情况和糖基化修饰。[结果]获得EGⅠ分泌表达菌株,诱导96 h后上清液活性为0. 513±0. 002 U/m L,纯化后的EGⅠ活性为0. 558±0. 012 U/mg。SDS-PAGE表明EGⅠ分子量在100～180 k Da,远高于预测值47. 3k Da,经肽N-糖苷酶F处理后,降至63～75 k Da。[结论]实现了EGⅠ的分泌表达,获得活性为0. 558±0. 012 U/mg的糖基化重组EGⅠ。
单增李斯特菌lmo2192基因克隆与表达 下载：81 浏览：499
摘要:
对单增李斯特菌新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2的lmo2192基因进行克隆及原核表达。[方法]利用PCR方法扩增lmo2192基因,连接p MD19-T载体进行克隆,筛选阳性菌进行测序比对。构建重组表达质粒p ET32a-2192,将其转入大肠杆菌感受态细胞,经诱导表达,利用SDS-PAGE与Western Blotting鉴定重组蛋白。[结果]扩增lmo2192基因序列长度为969 bp,与预期一致。该基因在大肠杆菌中大量表达,经SDS-PAGE和Western Blotting鉴定分析该产物为56 k Da左右的融合重组蛋白,与预期大小一致。[结论]成功克隆lmo2192基因,并获得大量表达,为进一步研究该基因功能奠定理论基础。
重组MBP-SUV39H1在大肠杆菌中表达与纯化 下载：76 浏览：495
尼罗罗非鱼ZAP-70蛋白的原核表达、纯化及其多抗制备 下载：84 浏览：500
摘要:
构建尼罗罗非鱼ZAP-70原核表达载体,纯化其重组蛋白并制备多克隆抗体。[方法]采用无缝克隆技术构建尼罗罗非鱼ZAP-70重组表达载体,并转入大肠杆菌B21中诱导表达,将表达的ZAP-70蛋白免疫日本大耳兔得到多克隆抗体,采用Western Blotting和ELISA技术鉴定抗体的特异性和效价。[结果]成功构建原核表达重组质粒p ET-B2m-ZAP-70,诱导表达的重组蛋白分子量约为39 k Da,主要以包涵体的形式表达;获得效价为1∶512 000的多克隆抗血清,WB检测显示该抗体能够特异性的识别所表达的ZAP-70重组蛋白。[结论]尼罗罗非鱼ZAP-70重组质粒在大肠杆菌B21中高效表达,分子量约为39 k Da,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步探索ZAP-70在尼罗罗非鱼免疫系统中的功能奠定了基础。
小鼠cofilin2蛋白的原核表达及纯化 下载：67 浏览：510
摘要:
构建小鼠cofilin2原核表达载体并纯化表达产物。[方法]以胚胎期小鼠心脏组织的c DNA为模板PCR扩增cofilin2基因,经酶切连接表达载体PGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E. coli BL21感受态细胞中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R-250进行染色,检测GST-cofilin2的表达情况。通过谷胱甘肽树脂(Glutathione Resin)亲和层析进行纯化,最后通过Western Blot进行验证。[结果]PCR成功扩增cofilin2基因,双酶切及测序结果表明p GEX-4T-1-cofilin2原核表达载体构建成功,SDS-PAGE鉴定表明,在22℃、200μmol/L的IPTG能诱导出大量可溶性的GST-cofilin2蛋白,分子量为43 k Da。Western Blot验证得到纯化的GST-cofilin2。[结论]成功构建小鼠cofilin2原核表达载体,纯化得到的重组小鼠cofilin2蛋白可用于后续的生物学研究。
