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金黄色葡萄球菌ymdB基因的克隆表达及生物信息学分析 下载：71 浏览：496
摘要:
克隆、表达金黄色葡萄球菌ymd B基因,并对其编码产物进行生物信息学分析。[方法]以金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌株的基因组DNA为模板,用聚合酶链式反应扩增ymd B基因,将扩增基因酶切后与表达载体pET-32a(+)连接,构建重组质粒并转化大肠杆菌TG1,增菌培养后提取质粒,经PCR、基因测序鉴定后,再转化大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株进行诱导后,进行10%SDS-PAGE分析。使用Protparam、PSORT、CDD、Signal P 4. 1、TMpred、Net Phos 3. 1 Server、PSIPRED、SWISS-MODEL等软件,分析YmdB蛋白的氨基酸数目、相对分子质量、理论等电点、带电荷氨基酸总数、半衰期、稳定性、疏水性、亚细胞定位、保守结构域、信号肽、跨膜区、磷酸化位点、二级结构、三维结构等。[结果]构建了表达载体pET-32a(+)-ymd B,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得表达。YmdB蛋白由266个氨基酸组成,相对分子质量为30134. 53Da,等电点为6. 23,正电荷氨基酸总数为33个,负电荷氨基酸总数为35个,在大肠杆菌内的半衰期为10 h以上,是稳定的亲水蛋白质,定位于细胞质中,与YmdB蛋白家族具有相似的保守结构域,没有信号肽,有一个跨膜区和14个磷酸化位点,二级结构中ɑ螺旋、β折叠和无规则卷曲分别占42. 11%、9. 40%、48. 49%,三维空间结构与二级结构预测结果大致相同。[结论]成功克隆、表达了金黄色葡萄球菌ymdB基因,并对YmdB蛋白进行了生物信息学分析,为深入研究该蛋白的分子作用机理打下一定基础。
大肠杆菌整合宿主因子的表达与纯化 下载：82 浏览：493
摘要:
构建大肠杆菌整合宿主因子两亚基的共表达载体并对其表达纯化条件进行探索。[方法]PCR扩增himA和hip基因,重叠PCR连接起来后利用重组酶连接到表达载体p ET-duet1中,筛选阳性重组子,转化Rosetta（DE3）表达菌,调整诱导时IPTG的浓度及诱导时间,确定最佳诱导条件,最后通过himA基因C端的6×His标签与镍的结合,进行蛋白纯化。[结果]成功扩增himA和hip基因;重组表达载体p ET-duet-himAhip经PCR和DNA测序鉴定构建成功; SDS-PAGE检测到大小约为11. 1 k Da和10. 7 k Da的目的蛋白,IHF的表达成功; 37℃,A600=0. 6～0. 8时,在IPTG终浓度分别为0. 2 mmol/L、0. 5 mmol/L条件下诱导2 h、4 h,目的蛋白的表达量没有明显区别。[结论]成功构建IHF两个亚基的共表达载体,在37℃诱导条件下简单快速得到等比例的可溶性IHF-α和IHF-β,为后续研究奠定基础。
水稻细胞质雄性不育相关基因orf290功能域的初步研究 下载：76 浏览：494
摘要:
探讨线粒体基因orf290主要功能结构域与水稻配子体细胞质雄性不育的关系。[方法]利用生物信息学方法,分析ORF290功能结构域,构建其不同功能结构域的表达载体,完成遗传转化,采用碘-碘化钾染色法观察阳性植株的花粉育性及小穗育性,统计分析ORF290功能结构域与育性的关系。[结果]与保持系相比,各功能结构域的转基因植株农艺性状的差异不明显,花粉育性及自然结实率均有所降低,35S::orf290（T0代）、35S::Rf1b 5'-orf290（T1代）、35S::Rf1b 5'-orf216（T0代）和35S::orf216（T0代）花粉育性（结实率）分别为:50. 7%（46. 5%）、33%（42. 15%）、38. 7%（37. 9%）和60. 8%（50%）。[结论]结果表明orf290是细胞质雄性不育相关基因,且ORF290功能结构域位于C端,N端具有线粒体定位信号。
胱硫醚β合酶新型抑制剂的发现和机制研究 下载：78 浏览：501
摘要:
旨在发现胱硫醚β合酶（Cystathionineβ-synthase,CBS）的新型抑制剂并研究其作用机制。[方法]通过构建血红素结合位点缺失或氧化还原位点突变的CBS突变体(CBS70-413和CBS C272A/C275A),基于该酶的测活方法和PLP荧光光谱分析,研究3个CBS新型抑制剂的抑制有效性及其分子作用机制。[结果]亲和纯化得到了有活性的CBS70-413和CBS C272A/C275A突变蛋白以用于抑制剂的机制研究。研究发现,CBS70-413突变体可高效拮抗这些抑制剂的抑制效果,而C272A/C275A突变则不行,提示这些抑制剂可与该酶的血红素结合位点结合而抑制该酶活力。进一步研究结果表明,它们可别构调控该酶辅基PLP的含量。[结论]3个抑制剂的分子作用机制为,通过与该酶的Heme位点结合,并通过该位点去别构调控PLP辅基与活力位点的结合,从而抑制该酶的活力。
