基于Nrf2/HO-1启动子筛选抗水生病毒药物的方法 下载：71 浏览：429
王靖雯1 吴苗苗1 李莉娟1，2 顾泽茂1，2 袁军法1，2 《水产研究进展》 2024年3期
摘要: 为建立基于Nrf2、HO-1启动子活性的抗病毒药物筛选方法，实验以胖头鱥上皮细胞系(FHM)为材料，构建Nrf2、HO-1启动子重组质粒，利用双荧光素酶报告系统检测不同浓度(0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0μg/mL)的白藜芦醇、水飞蓟宾、穿心莲内酯及姜黄素对启动子活性的影响，并利用鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus，SVCV)和蛙虹彩病毒(rana grylio iridovirus，RGV)验证阳性药物的抗病毒效果。结果显示，Nrf2、HO-1启动子序列中存在FOX家族、IRF家族等多种转录因子的结合位点，并分别存在1个和3个与甲基化相关的CpG岛。双荧光素酶报告实验显示，水飞蓟宾、穿心莲内酯及姜黄素可激活Nrf2、HO-1启动子。药物浓度梯度实验显示，6.3μg/mL的姜黄素和穿心莲内酯可显著上调Nrf2和HO-1的启动子活性。病毒感染后的细胞病变效应、病毒的复制及病毒滴度结果均表明姜黄素和穿心莲内酯可抑制SVCV和RGV的感染。综上，本实验建立的pGL3-Nrf2和pGL3-HO-1启动子报告质粒，可用于抗水生病毒药物的筛选，也为Nrf2、HO-1转录调控机制的研究提供了工具。
鳡和翘嘴鲌精子诱导彭泽鲫雌核发育子代的异精效应研究 下载：71 浏览：458
操文杰 张静蓉 张庆飞 赵玉华 王卫民 《水产研究进展》 2023年1期
摘要: 为探究鳡和翘嘴鲌精子在诱导彭泽鲫雌核发育子代中的异精效应，实验分别以鳡和翘嘴鲌精子激活彭泽鲫卵的胚胎发育获得子二代(F2)群体：P×G (彭泽鲫♀×鳡♂)和P×Q(彭泽鲫♀×翘嘴鲌♂)，以P×P (彭泽鲫♀×彭泽鲫♂)F2为对照，比较各群体的染色体核型、DNA含量、形态学特征以及生长等。结果显示，P×G、P×Q和P×P的核型分别为3n=150=45m+66sm+27st+12t、3n=150=54m+51sm+39st+6t和3n=150=51m+48sm+45st+6t，与父本鳡的核型(2n=48=10m+24sm+12st+2t)和翘嘴鲌的核型(2n=48=16m+26sm+6st)明显不同；P×G和P×Q的DNA含量与P×P比值在95%的置信区间内(均为0.97)；上述结果表明，P×G和P×Q的F2群体均为雌核发育子代。基于形态学参数的主成分分析显示，P×G和P×Q与P×P散点分布区域基本无重叠；P×G和P×Q与P×P间能通过判别函数进行初步判别(准确率达97.8%)，即存在显著的形态学差异；这表明P×Q和P×G子代存在异精效应。与P×P相比，P×G和P×Q的F2群体各日龄的平均体重、平均体长、增重率和增长率均表现出优势，且P×G优势显著。综上所述，鳡和翘嘴鲌精子均能诱导彭泽鲫卵的雌核发育，且不同的精子源诱导对雌核发育子代的影响不同，存在典型的“异精效应”。
黄颡鱼STAT3乙酰化位点验证及其与SIRTs去乙酰化酶的关系 下载：83 浏览：438
郑华 徐一闯 赵涛 吕武宏 余岸艮 何杨 谭肖英 《水产研究进展》 2022年4期
摘要: 为研究黄颡鱼STAT3乙酰化位点及其与SIRTs去乙酰化酶家族之间的关系，实验首先构建带Flag标签的STAT3过表达质粒及带HA、GFP标签的SIRTs过表达质粒，并对STAT3可能发生乙酰化的位点进行突变体构建；其次，转染STAT3及突变体和STAT3、SIRTs共转染于HEK 293T细胞，利用免疫印迹、免疫沉淀和免疫荧光等技术进行检测。结果显示，STAT3是一种胞浆蛋白。与野生型STAT3相比，突变体K685R的乙酰化水平显著降低。突变体K49R、 K87R、 K680R、 K712R和K714R的乙酰化水平与野生型STAT3无显著差异，表明K685是STAT3的关键乙酰化位点。免疫沉淀和免疫荧光结果显示，SIRT2、SIRT7与STAT3发生蛋白互作并催化STAT3的去乙酰化，而SIRT5不与STAT3发生蛋白互作，对其乙酰化水平无明显影响。本研究揭示了黄颡鱼STAT3的乙酰化位点及STAT3和SIRTs之间的关系，为探讨STAT3蛋白乙酰化修饰在鱼类生理功能中的作用奠定基础。
两种单色鲤皮肤转录组特征分析 下载：49 浏览：253
史东杰1,2 张强3 伍仕弘4 高坚5 魏东6 张欣1,2 王赛赛1,2 孙砚胜1,2 姜巨峰7 李文通1,2 杨昊坤1,4 《中国水产学报》 2023年2期
摘要: 为了探究全红鲤(Cyprinus carpio)和全黄鲤的基因资源，采用Illumina Hi-seq测序技术对两种单色鲤的皮肤进行转录组测序，并对差异表达基因进行注释和富集分析。结果表明：对体长为(33.42±0.24)cm的全红鲤和体长为(38.75±0.43)cm的全黄鲤皮肤测序，分别获得干净数据(clean reads)为129 222 850和130 869 572个；与Nr、Nt、COG、GO、KEGG、Pfam和Uniprot数据库中已知基因进行比对，分别有58 782、61 490、11 468、31 206、31 581、61 385和51 805个基因获得注释，7个数据库中均有注释的基因数为8 378个；在全红鲤和全黄鲤皮肤中存在4 822个差异表达基因，其中，显著上调1 929个，显著下调2 893个；取其中9个差异表达基因进行qRT-PCR验证，证实了转录组数据结果的可靠性；在差异表达基因中，筛选获得了部分参与体色调控的基因，包括mitfa、ednrA、wnt7、agouti和mif等；KEGG分析发现，差异表达基因极显著富集在甘露糖与果糖代谢、糖酵解/糖原异生途径、碳代谢、磷酸戊糖途径和酪氨酸代谢等43条通路；对酪氨酸代谢和黑色素合成通路分析发现，与红色素和黄色素合成相关的基因mif、mif4g、agouti、ednrA和ednrB等显著上调，与黑色素合成相关的基因tyr、tyrp1、mitfa和wnt7等显著下调；差异基因变异分析发现，全红鲤和全黄鲤中均存在的单核苷酸多态性标记(SNP)共388 673个。研究表明，两种单色鲤皮肤组织中差异表达基因主要富集在能量代谢、生长和免疫等通路中，获得的转录组信息可为今后锦鲤分子标记的开发及功能基因的克隆、编辑和功能分析等提供基础数据。
草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型自然发病与人工注射感染草鱼的病理症状和病毒分布研究 下载：73 浏览：415
杨玲1，2，3 苏建国1，2，3 《水产研究进展》 2022年3期
摘要: 为了探究自然发病和人工注射感染草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型(GCRV-Ⅱ型)草鱼的临床症状、病理特征和病毒分布的区别，实验采用临床剖检、组织病理学观察、分子生物学检测、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)等检测方法开展实验，通过对自然发病和人工注射感染草鱼的临床症状进行比较，结果显示，患病草鱼的眼眶、鳃盖、口腔、腹部、鳍条基部、肠道、肌肉出现明显的点状出血，且后者的出血情况比前者更为严重；比较组织病理切片，发现草鱼感染组织出现不同程度的充血和红细胞充盈现象，其中，人工注射感染草鱼的肠道、肌肉和肝胰脏的病变程度更为严重，呈现出较为严重的组织内出血和病变，而自然发病草鱼的鳃和脾脏的病变程度更为严重，鳃呈现出较为严重的充血和炎症增生物，脾脏出现大面积含铁血黄素沉积块病灶。qRT-PCR和Western blot检测结果显示，GCRV在不同的组织中均有分布，头肾在两种感染方式的患病草鱼中的病毒量都比较高，人工注射感染草鱼的肝胰脏、肠道和肌肉的病毒量较高，自然发病草鱼的中肾、鳃和脾脏的病毒量较高。因此，在人工注射感染时，肝胰脏、肠道和肌肉可能是GCRV入侵的主要靶器官，而在自然发病时，鳃可能是GCRV入侵的主要靶器官，病毒聚集靶器官都是头肾，头肾是GCRV的“病毒库”。本研究有助于深入解析GCRV的发病机制和草鱼的免疫响应，同时为草鱼出血病的防治和疫苗的研发提供参考。
VP35蛋白对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒增殖的影响 下载：72 浏览：475
摘要: Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)基因片段S11编码外衣壳蛋白VP35。为深入探究VP35蛋白在病毒增殖中发挥的作用，实验扩增了S11基因并插入载体pCMV-3×flag中，构建pCMV-3×flag-S11真核表达质粒，转染草鱼肾细胞(CIK)后感染Ⅱ型GCRV，收集感染后的上清液与细胞。首先利用实时荧光定量PCR中相对定量的方法检测细胞样品中Ⅱ型GCRV-S6基因的mRNA。结果显示，过表达VP35在病毒mRNA水平促进Ⅱ型GCRV的增殖；然后扩增S6基因并插入到载体pET-32a(+)中，构建重组原核表达质粒，纯化Ⅱ型GCRV-VP4蛋白并制备多克隆抗体，用Western blot检测收集的细胞样品中的VP4蛋白，结果表明过表达VP35在病毒蛋白水平促进Ⅱ型GCRV的增殖；最后使用pET-32a-S6质粒作为阳性标准质粒并制作标准曲线，建立Ⅱ型GCRV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，利用该方法检测细胞上清液中的病毒颗粒，结果表明过表达VP35增加Ⅱ型GCRV病毒拷贝数。本研究从3个维度证明过表达VP35蛋白促进Ⅱ型GCRV增殖，有助于深入解析VP35蛋白功能，也为进一步探究Ⅱ型GCRV的致病机制提供理论基础。
二倍体泥鳅与大鳞副泥鳅及杂交F1精子结构与活力 下载：79 浏览：439
摘要: 二倍体泥鳅与大鳞副泥鳅杂交能够顺利获得杂交后代，其正反交核型都为（2n=49），但杂交后代精巢表现出明显的发育迟缓现象，杂交泥鳅自交与回交实验表明，其雄性不可育。为了解二倍体泥鳅和大鳞副泥鳅杂交F1雄性不育的原因，实验通过计算机辅助精子活力分析系统（CASA）、光学显微镜、扫描电镜、透射电镜、流式细胞技术分别对二倍体泥鳅（DD）、大鳞副泥鳅（PP）、其正反杂交F1（DP）和（PD） 4种泥鳅精子的形态结构与活力进行了分析。结果显示，激活30 s时，DD和PP的精子运动率分别为76.50%±0.70%和75.17%±8.60%，极显著高于DP （3.65%±1.75%）和PD （2.68%±0.63%），且杂交泥鳅的精子的平均运动速度（VAP）、平均曲线速度（VCL）、平均直线运动速度（VSL）等运动参数也极显著低于DD和PP，说明杂交泥鳅精子的活力极其低下。应用流式细胞技术对4种泥鳅精巢内细胞进行倍性鉴定，发现DD和PP精巢内大多为1N精子，而DP和PD精巢内除了正常单倍体精子外，还有大量的2N和4N以及少量的8N细胞。通过扫描电镜和透射电镜发现，DD与PP精巢内精子细胞致密、结构完整、大小均匀，其全长分别为（33.71±2.12）和（34.28±1.83）μm。而DP和PD精巢内的精子其头长显著高于DD和PP的精子，其尾长、中片长和全长皆显著低于DD和PP的精子。研究表明，杂交泥鳅的精子与正常精子相比，在精子形态和内部DNA含量方面表现出明显多态性。这可能是造成杂交泥鳅雄性不育的原因。杂交泥鳅中出现了大量的异常精子，如多尾精子、双核精子以及大头精子，根据测量，其头部大小也表现出明显的多态性，根据头部体积大小测量估算其倍性，其中有正常的精子即单倍体精子，同时有二倍体精子、四倍体精子、八倍体精子甚至更高倍性的精子。这些杂交泥鳅的异常精子为其精子活力低下以及雄性不育提供了重要证据。
团头鲂Hox基因家族的鉴定、进化与表达分析 下载：82 浏览：466
摘要: 为探究团头鲂Hox的分布、进化及表达调控，实验基于团头鲂全基因组数据，结合生物信息学分析方法对Hox基因家族进行鉴定、染色体分布、系统进化和表达分析。结果显示，团头鲂基因组中鉴定有49个Hox，根据系统进化树聚集为5个亚类；49个Hox分属于7个基因连锁群(HoxAa、HoxAb、HoxBa、HoxBb、HoxCa、HoxCb和HoxDa)，并且不均匀地分布在5条染色体上；团头鲂Hox基因家族成员具有不同的表达模式，在肌肉中的表达水平与斑马鱼所有Hox的表达存在显著差异；团头鲂不同发育阶段及不同组织的转录组结果显示，在HoxA基因群中，HoxA2a和HoxA3a在幼鱼阶段高表达，其他基因在肌肉、肌间刺及结缔组织中表达量低甚至不表达；HoxB基因群中，HoxB9a、HoxB3a、HoxB8a、HoxB1b、HoxB5a和HoxB5b在幼鱼阶段高表达，HoxB7a、HoxB10a和HoxB9a在成鱼肌肉、结缔组织及肌间刺中高表达；HoxC基因群中，HoxC3a和HoxC4a在幼鱼阶段高表达，HoxC3a和HoxC8a在成鱼的3个组织都有表达；HoxD基因群中，HoxD9a、HoxD10a和HoxD11a在胚胎S2期表达量较高。研究表明，Hox在团头鲂早期胚胎时期和肌间刺的形成中有表达，提示团头鲂肌间刺的形成可能受Hox基因家族调控。
鳜下丘脑神经元细胞培养 下载：79 浏览：474
旷玉兰1，2 梁旭方1，2 蔡文静1，2 何珊1，2 徐晶1，2 高俊杰1，2 魏君冉1，2 《水产研究进展》 2021年5期
摘要: 为了建立可行、高效的下丘脑神经元细胞技术，本研究通过分离鳜下丘脑组织，用Ⅰ型胶原酶将组织消化成单细胞悬液，并用完全培养液进行培养，在培养的第3、4、5和6天观察细胞的形态。结果显示，培养第3天时细胞贴壁量少，胞体小并且呈单个分布；在培养第4天，细胞的数量显著增多，且具有典型的神经元的形态，胞体饱满；第5天神经元胞体的融合度进一步增大，突起增长增粗，许多分支互相交错连接而形成密集的神经纤维网络；第6天细胞活性减弱，开始凋亡。使用CCK-8法检测细胞活性，结果显示，在培养第5天，细胞活性最高；采用荧光定量PCR(RT-PCR)法和免疫荧光鉴定法对神经元细胞进行鉴定，经RT-PCR检测发现，培养的下丘脑细胞可以表达神经元特异基因noggin，经免疫荧光鉴定，下丘脑神经元细胞纯度为95.9%。研究表明，通过此培养方法能够获得纯度较高的鳜下丘脑神经元细胞，为进一步在细胞水平研究鳜的摄食与能量代谢相关机理奠定基础。
液质联用技术测定甲砜霉素及其在斑点叉尾鮰体内的药代动力学 下载：80 浏览：467
杨秋红1 李司棋2 宋怿3 刘永涛1，3 董靖1 杨移斌1 周顺1 胥宁1 艾晓辉1，3 《水产研究进展》 2021年3期
摘要: 实验建立了斑点叉尾鮰体内各组织中甲砜霉素的高效液相色谱—串联质谱法，方法中甲砜霉素浓度在5～100 ng/mL范围内呈线性相关，相关系数为0.998，平均回收率为79.05%～95.58%，相对标准偏差为2.01%～9.36%，血浆中甲砜霉素的定量限为5.0μg/L，肌肉、皮肤、肾脏和肝脏中甲砜霉素的定量限为5.0μg/kg。实验在水温为28°C条件下，单次口灌(按照每kg体质量口灌17.5 mg的剂量)甲砜霉素，并用高效液相色谱—串联质谱法测定各组织中的药物浓度，采用3p97药代动力学软件处理药—时数据，研究斑点叉尾鮰体内的药代动力学特征。结果显示，甲砜霉素血浆药—时数据符合一级吸收二室模型，血药达峰时间(Tpeak)为8.00 h，血药浓度峰值(Cmax)为933.75μg/L，药时曲线下面积AUC为12.10 mg/L，消除半衰期(T1/2β)为69.32 h，吸收半衰期(T1/2ka)为4.97 h。药代动力学结果表明，甲砜霉素在斑点叉尾鮰体内呈二室模型分布，以一级药代动力学方式消除。该方法简单可靠，满足甲砜霉素的测定及药代动力学研究的要求。
不同动物饵料对YY超雄黄颡鱼性腺发育的影响 下载：77 浏览：468
熊阳1 王帅1 郭稳杰1 徐江2 陈丽慧2 刘汉勤2 梅洁1 《水产研究进展》 2020年4期
摘要: 通过比较近10年YY超雄黄颡鱼的生产和养殖记录，发现仅近几年投喂过水蚯蚓的YY超雄黄颡鱼性腺出现问题。实验设定4组不同饵料(丰年虫、浮游动物、红虫和水蚯蚓)连续投喂YY黄颡鱼鱼苗20 d(11～30日龄)，选择60日龄统计各组YY超雄黄颡鱼的存活率、体长和体质量。水蚯蚓组YY超雄黄颡鱼的体长和体质量显著高于其他3组，丰年虫组YY超雄黄颡鱼存活率显著低于其他3组。解剖观察60日龄和1年龄YY黄颡鱼的性腺结构并统计1年龄YY超雄鱼的受精率，结果显示，水蚯蚓组YY超雄黄颡鱼的性腺有75%为兼性性腺(精巢和卵巢均存在)，25%为无精小叶的精巢，且1年龄的YY黄颡鱼受精率仅为36.70%±4.05%，并显著低于其他3组，而其他3组性腺发育和受精率均正常。为研究水蚯蚓引起YY黄颡鱼雌性化具体原因，实验测量4种不同动物饵料的雌二醇含量，发现雌二醇含量均较低，推测YY超雄黄颡鱼雌性化的原因可能是水蚯蚓富集的环境内分泌干扰物(EDCS)导致。研究表明，在YY超雄黄颡鱼大规格苗种培育过程中，早期应投喂浮游动物或红虫，不宜投喂水蚯蚓。
鳜脑神经元的原代培养与鉴定 下载：78 浏览：467
石林杰1，2 梁旭方1，2 何珊1，2 彭建1，2 《水产研究进展》 2020年2期
摘要: 目前鱼类神经细胞模型极少，物种间的差异性使鳜在细胞水平上的研究具有极大的局限性，为建立一种简单易行的鳜脑神经元细胞模型进一步研究鳜神经系统，本实验取3月龄鳜，联合胶原酶消化法和机械吹打法分离出鳜脑细胞，用含20%FBS的L15培养液制成细胞悬液接种在细胞培养瓶内，于28°C无CO2培养箱中培养，3 d后更换培养基，待细胞贴壁长满瓶底后进行传代培养；采用Neu-N和β-tubulin免疫荧光细胞化学技术鉴定鳜脑细胞神经元纯度。结果显示，鳜脑细胞分离培养2 d后贴壁状态较好，随着时间延长，贴壁细胞增多，细胞突起相互连接，培养5 d后神经元胞体丰满，细胞数量明显增多，突起相互间形成了明显的神经网络。经Neu-N和β-tubulin免疫荧光细胞化学技术鉴定鳜脑神经元细胞纯度可达95%以上。研究表明，该鳜脑细胞的分离培养方法简单易行，且可获得高纯度的鳜脑神经元细胞。
主养草鱼与主养黄颡鱼池塘沉积物—水界面氮磷营养盐通量变化及与环境因子的关系 下载：86 浏览：502
皮坤 张敏 李保民 李庚辰 《水产研究进展》 2018年3期
摘要: 为了探讨不同主养模式池塘养殖期间沉积物—水界面氮磷营养盐通量变化特征以及与环境因子之间的相互关系，利用沉积物—水界面营养盐扩散通量的原位观测装置，分析了2013年4—10月主养草鱼和主养黄颡鱼池塘沉积物—水界面营养盐交换通量，并探讨了影响营养盐交换通量的因素。结果发现:(1)在养殖初期，各种形态氮磷在养殖池塘沉积物—水界面主要表现为从上覆水向沉积物的沉积，养殖中后期，由于温度升高以及池塘沉积物中营养物质的大量累积，各种形态氮磷表现为以沉积物向上覆水扩散为主，表明池塘沉积物是氮磷营养盐的源与汇；(2)两种不同主养模式池塘氮磷通量的统计结果表明，沉积物—水界面-N、-N和-P通量变化无显著差异，而-N、TN和TP通量有显著差异；(3)上覆水中DO含量的升高显著促进界面间-N和-N释放通量，而-N和-P释放通量与上覆水DO浓度成显著负相关；温度的升高对各种无机形态的氮磷通量有显著的促进作用。
