1 引言
1.1鼠伤寒沙门氏菌
近年来，生物膜菌体的研究备受关注。生物膜是一种由微生物聚集而成的三维结构，是微生物有组织生长的聚集体。细菌不可逆的附着于惰性或活性实体的表面，繁殖、分化，并分泌一些多糖基质，将菌体群落包裹其中而形成的细菌聚集体膜状物。单个生物被膜可由一种或多种不同的微生物形成。我国四大名腌菜之一的襄阳大头菜在制作的时候，因为环境等其他不可控因素从而导致在腌制的过程中缸的表面会行程一层生物膜，这样会导致菜发出刺激性气味失去经济价值。[1] 生物膜的存在使细菌对抗外界环境的能力得到了增强。
鼠伤寒是由鼠伤寒沙门氏菌引起的疾病，是一种常见的食源性疾病。沙门菌是一种常见的细菌，可以在动物和人体内生长并引起感染。鼠伤寒沙门菌是一种重要的人畜共患病原菌，常常会形成生物膜，其生物膜菌体对传统抗生素的抵抗力很强，导致感染难以根治，其感染发病率居沙门菌感染的首位，约占人源沙门菌感染的40%～80%，患者会出现发热、腹泻、腹痛、呕吐等症状，可引起胃肠炎、伤寒、败血症，多见于婴幼儿，轻者可自愈，重者可危及生命，可导致医院感染和暴发性食物中毒，病死率较高[2]。鼠伤寒沙门菌感染后，部分患者还会出现关节痛和皮疹等症状，对于老人和儿童来说，影响更为严重。
鼠伤寒沙门菌可以通过多种途径侵入人体，但主要是通过被污染的食物或水经口传播，其中，食物是最常见的传播途径。鼠伤寒沙门菌主要存在于动物肠道内，如鸡、鸭、兔等。如果这些动物受到感染，它们的肠道内就会大量存在沙门菌。如果人们食用了这些动物的肉或者吃了没有处理干净的蔬菜和水果，就很容易感染沙门菌。此外，沙门菌还可以通过接触感染源，如感染沙门菌的人或动物的粪便、尿液等，进入人体内。其临床表现多样，潜伏期多数为12～72小时，最短2小时，最长可达一个月。
我国禽肉和禽蛋感染沙门氏菌的血清型多种多样，有些种类有宿主特异性，如鸡伤寒( S． gallinarum) 和鸡白痢( S． pullorum) ，我国是一个禽肉生产和消费大国，在我国禽肉产业中，沙门氏菌污染是一个长久而持续性的问题。随着经济社会的发展，居民消费水平的不断提高，在防治畜禽食品种沙门氏菌污染上，我们将面临更加严峻的挑战。[3]
现有研究中提出了一些沙门氏菌的防治方法，例如：
1、做好食品卫生：避免生食或未加热熟透的食物，尤其是鸡肉、鸡蛋、牛奶等易受污染的食品。食品加热要达到70℃以上，以杀死沙门氏菌。
2、保持个人卫生：勤洗手，特别是在处理食物前后、使用洗手间后等场合。避免接触和摸动口鼻、眼睛等部位。
3、加强环境卫生：定期清洁和消毒厨房、餐具、餐具、厨房用具等，减少沙门氏菌的滋生。
4、注意饮食健康：多喝水，保持正常的饮食规律，增强身体免疫力，减少沙门氏菌感染的风险。
5、疫苗防治：口服疫苗和注射疫苗。
6、控制传染源：不食用患病牲畜，防止水源被感染，保护饲料，定期给牲畜做体检，保持良好卫生等。
1.2乳酸
1808年Berzelius第一次在鹿运动后的肌肉发现乳酸，随后的100年后人们认识到乳酸可以为肌肉收缩提供能量，并且乳酸的积累可以导致肌肉疲劳，在20世纪80年代人们认识到乳酸是糖酵解的终产物。[4]
乳酸是一种常用的食品酸味剂，也被广泛应用于食品、医药以及日化等领域。在食品领域，乳酸可以作为发酵剂、酸度调节剂和保鲜剂使用。它被广泛应用于乳制品、面包、肉制品、腌制食品和饮料等食品产品中。乳酸不仅可以增加食品的酸度和特殊风味，还可以抑制食品中的细菌和霉菌生长，延长食品的保质期。在医药领域，乳酸被用作药物的原料和助剂。它可以作为治疗骨质疏松症、贫血和病理性代谢性酸中毒等疾病的药物原料，也可以作为缓释剂、增稠剂和溶解剂等药物助剂。在日化领域，乳酸被广泛应用于护肤品、洗发水和清洁剂等产品中。它可以作为调节剂、保湿剂和防腐剂使用，能够改善皮肤和头发的质地和保湿效果，延长产品的保质期。
乳酸是一种常见的有机酸，其分子结构中含有羧基和羟基，分子式为C3H6O3，属于α-羟酸（AHA）。乳酸抑菌主要是靠改变菌生长环境的pH值从而破坏细菌的细胞膜，从而破坏细菌的内部DNA以达到杀菌的效果。其可以通过这些官能团与细菌细胞膜上的氢离子发生作用，使细胞膜的pH值下降，从而破坏了细胞膜的完整性，导致细胞死亡。此外，乳酸还可以通过影响生物膜的形成和稳定性，进一步破坏细菌的生物膜结构。
研究表明，乳酸对生物膜菌体具有较强的杀菌效果。一方面，乳酸可以直接破坏生物膜菌体的结构，减轻其对抗外界环境的能力；另一方面，乳酸还可以促进生物膜菌体脱落，从而增加其易感性。
总而言之，乳酸作为一种天然的有机酸，具有较低的毒性和副作用，因此可以作为一种潜在的抗菌剂应用于临床治疗。此外，乳酸还可以通过调节肠道微生物群落的平衡，增强机体对细菌的免疫力，从而预防鼠伤寒沙门氏菌等疾病的发生。
1.3研究目的与意义
本研究使用生物膜作为杀菌的样本是因为鼠伤寒沙门氏菌生物膜比游离菌体更难杀死，本实验旨在研究乳酸这一天然物质对于鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果。近年来，乳酸的杀菌效果备受关注：
1、天然安全：乳酸是一种天然有机酸，无毒、无害，不会对人体造成危害。因此，乳酸杀菌被视为一种天然安全、无害的食品杀菌方法。
2、高效节能：乳酸杀菌不需要高温高压，不会对食品质量造成影响，可以保持食品的原有营养成分和口感。相比传统的加热杀菌方法，乳酸杀菌可以大大降低能源消耗，从而实现高效节能。
3、生态环保：乳酸杀菌是一种绿色环保的食品杀菌方法。传统的加热杀菌方法会产生大量的能源消耗和二氧化碳排放，对环境造成很大的压力。而乳酸杀菌不需要高温高压，可以大大降低能源消耗和对环境的污染。
4、广泛应用：乳酸杀菌可以应用于各种食品和饮料的杀菌处理，如果汁、乳制品、肉制品等。乳酸杀菌还可以应用于医药、化妆品、生物制品等领域。
综上所述，乳酸杀菌是一种安全、高效、环保的食品杀菌方法，具有广泛的应用前景和研究价值，研究乳酸对鼠伤寒沙门氏菌生物膜菌体的杀菌效果具有重要的应用意义。
2材料与方法
2.1实验材料
2.1.1实验材料与仪器
EB配置粉末，培养皿，鼠伤寒沙门氏菌 恒温培养箱，
2QLY-180F振荡培养箱(上海知楚仪器有限公司）
JB-CJ-1FX洁净工作台（苏州佳宝净化工程设备有限公司）
XW-80A旋涡振荡器 （海门市其林贝尔仪器制造有限公司）
移液器 （德国Eppendorf公司）
GWJ纯水机 （上海宝尔水处理有限公司）
电子天平 （上海光正医疗仪器有限公司）
AF100-AS制冰机（意大利Scotsman公司）
MDF-U53V医用低温箱 （日本松下健康医疗器械有限公司）
立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂）
2.2实验方法
2.2.1菌种活化
用NB粉末与纯水配置NB液体培养基（用于活化菌种），用NB粉末 纯水 与琼脂配置固体培养基。把液态的固体培养基倒入培养皿的四分之三，待其凝固后，从-80°的冰箱中拿出鼠伤寒沙门氏菌的菌液 放到医用冰盒中备用，用枪头沾取适量的菌液然后在已经凝固的固体培养基上画“之”字形，然后放置于37°C中过夜培养。挑取适量沙门氏菌单菌落接种于含有5ml NB液体培养基的试管中，180rpm、37°C下在摇床中振荡培养 6-8 h。
2.2.2培养二代菌
吸取一代游离菌体140ul至装有7mlNB液体培养基的试管中，再次放入摇床中180rpm、37°C 震荡培养6-8h
2.2.1.3培养生物膜
把培养好的二代菌液以1：100的比例稀释，加入12孔板中,每个孔加（1000ul），然后放入恒温培养箱中（37° 72h 每24小时换一次培养基）。
2.2.1.4清洗生物膜
每个孔吸出900ul的液体，加入生理盐水1000ul,然后再吸出生理盐水1000ul,然后再加入生理盐水1000ul，然后再加入生理盐水1000ul，最后吸出生理盐水。
2.2.1.5分浓度杀菌反应
乳酸与纯水稀释出浓度为1.6%与浓度为0.8%的乳酸溶液。在12孔板中选取9个孔，分成三组，三个孔一组，并做好标记，分别为浓度为0的一组三个（往里加入1ml的生理盐水），浓度为0.8的一组三个（往里加0.8%浓度的乳酸溶液1ml），浓度为1.6的一组三个（往里加1.6%的乳酸溶液1ml）。
2.2.1.6采样分组做平行
37°放置3h时间以后 分别吸取其中的液体并加入到对应的装有9ml生理盐水的试管中，用经过高温杀菌的棉签擦拭孔内剩余的固体，然后把相应的棉签头折断放进对应的试管中，充分摇晃。
2.2.1.7梯度稀释
从相应试管中吸取100ul至相应的浓度为10的负二次方的离心管中，吹打混匀，并以此类推梯度稀释完至其他的离心管中。
2.2.1.8培养菌落
选取乳酸浓度为0% 稀释浓度为10的负六次方的离心管三管，乳酸浓度为0% 稀释浓度为10的负五次方的离心管三管，所有乳酸浓度为0.8%的离心管，以及所有乳酸浓度为1.6%的离心管，从每一管里吸取两次100ul分别加到两个固体培养基上，涂布均匀，然后放入恒温培养箱中（37° 24h）。二十四小时后进行菌落计数并进行数据处理。
3 实验结果与讨论
表1 不同浓度乳酸对鼠伤寒沙门氏菌生物膜的杀菌效果
图1 不同浓度乳酸对沙门氏菌生物膜细胞的抑菌效果
对照组的平均值为8.9，pH至为8.03（中性偏碱），随着乳酸浓度增加到0.8%时其pH值为2.62（酸性），其菌落平均值降低到6.9，当乳酸浓度增加一倍至1.6%时其pH值为2.25（酸性），菌落平均值继续降低，到5.9。由此可知，乳酸浓度越高，其pH值越低，对鼠伤寒沙门氏菌生物膜破坏性越强，从而使菌落数量减少。此实验的标准差较低，侧面反映了实验的严谨性
通过实验可知，在一定浓度范围内，乳酸能够有效地杀死鼠伤寒沙门氏菌生物膜菌体，且杀菌效果随着乳酸浓度的增加而增强。
4 讨论
鼠伤寒沙门氏菌的杀菌方式有很多种，超声联合1%的乳酸可以在30分钟内完全杀死沙门氏菌游离细胞。[5]但在本实验中，1.6%的乳酸并不能杀死所有沙门菌，今后可以尝试使用乳酸联合其他方法做实验。本实验设计了三组平行样，以保证实验的严谨性以及产出数据的可靠性。因为生物膜比游离菌体更难杀死，所以如果在以生物膜为对象的实验中样本展现了不错的杀菌效果，那么样本对于同一种菌的游离菌体的杀菌效果会更好。实验结果表明，乳酸浓度越高，对鼠伤寒沙门氏菌杀菌效果越为明显，我们实验使用了三组平行以保证实验结果的准确性。
5 结论
研究了乳酸对于鼠伤寒沙门氏菌生物膜的杀菌效果，结果表明浓度为0.8%与1.6%的乳酸具有杀菌效果且浓度越高，杀菌效果越为明显，其原理为乳酸降低沙门氏菌生长环境的ph值，以破坏细菌的细胞膜，从而破坏细菌的内部DNA，最终达到杀菌的目的。
综上所述，乳酸对鼠伤寒沙门氏菌生物膜菌体具有一定的杀菌效果，应用乳酸可以作为一种较为有效的杀菌方法，同时也可以作为一种潜在的抗菌剂应用于临床治疗。乳酸的研究还有助于深入了解生物膜菌体的形成和稳定性，为寻找新的抗菌方法提供了新的思路。此外，我们也需要进一步研究乳酸对其他细菌的杀菌效果，以期能够更好地应用乳酸于医药和食品等领域中。
参考文献
[1]王意银. _昆明地区部队驻地细菌性腹泻病原监测[D]. 第三军医大学, 2012
[2]赵慧君,沈馨,董蕴,等. _襄阳大头菜腌制液生物膜真菌多样性研究[J]. 中国调味品, 2017, 42(12): 61-65.
[3]尹德凤.食品中沙门氏菌污染研究现状[J].江西农业学报,2015,(11):55-60,72.
[4]张琪,赵晓璇,李新旺. _乳酸影响记忆的神经机制[J]. 生物化学与生物物理进展: 1-15.
[5]孙晋跃,张衡,张娇娇,等. _超声联合乳酸处理对沙门氏菌游离及生物膜菌体的杀菌作用[J]. 中国食品学报, 2022, 22(10): 270-278.
