确定白沙蒿在干旱胁迫下起渗透调节作用的脯氨酸合成基因P5CS的生物信息学特征。[方法]对白沙蒿进行田间最大持水量的70%、40%及30%的干旱胁迫处理,再对其进行转录组测序获得不同胁迫处理下的差异表达基因,并筛选显著上调表达的P5CS,对其进行序列分析。[结果]P5CS对白沙蒿的抗旱性起调控作用,该基因序列全长为3 061 bp,包含长为2 145 bp的一个完整的开放阅读框(ORF),共编码714个氨基酸。等电点为6. 12、分子式为C3403H5539N965O1042S16、分子质量为77 157. 21 k Da,为亲水性蛋白,其序列同源性与黄花蒿最高,为93%。二级结构组成中α螺旋占的比例最高(40. 62%),无跨膜结构,主要分布在细胞质中。[结论]在干旱胁迫下,白沙蒿脯氨酸合成基因P5CS通过显著上调表达,参与了白沙蒿的抗旱调控。

分析解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)双组分信号转导系统(Two-Component Signal Transduction System,TCS)的结构、功能和分布,为挖掘解淀粉芽孢杆菌的生物功能、开发其商业价值提供理论依据。[方法]采用生物信息学方法,系统分析了由笔者实验室分离得到并完成全基因组测序的解淀粉芽孢杆菌Q426的TCS。[结果]Q426菌株所携带的HKs和RRs分别为42和40,其中成对的TCS(HK-RR)数为19,杂合的TCS(Hybrid)为1,而HKs和RRs分别为22和20,并对19对TCS中15对的生物学功能做出预测。[结论]Q426菌株的TCS涉及杆菌肽、羊毛硫抗生素和多种抗菌肽的合成,为深入研究解淀粉芽孢杆菌抗菌活性物质的合成与调控提供思路。

获得有活性的缓激肽药物,探讨缓激肽在心肌细胞缺氧复氧过程中的保护作用。[方法]利用PCR方法构建p Waldo-BK质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株,优化诱导剂IPTG浓度和表达温度;利用镍柱亲和层析和分子筛纯化缓激肽融合蛋白质,利用GFP荧光In-gel检测蛋白质的表达情况;构建心肌细胞缺氧复氧模型,检测缓激肽对细胞的保护作用。[结果]成功构建p Waldo-BK表达载体,0. 2 mmol/L IPTG于25℃诱导培养20 h,能够获得高表达的目标蛋白质; In-gel荧光检测证实,融合蛋白GFP能够发出绿色荧光;心肌细胞缺氧复氧模型证实缓激肽能够有效保护心肌细胞。[结论]0. 2 mmol/L IPTG、25℃诱导表达20 h,得到散发绿色荧光的融合蛋白,每1L BL21(DE3)细胞培养基能够获得缓激肽约0. 55 mg,且最终获得的缓激肽能够有效保护心肌细胞对抗缺氧复氧刺激。

对金黄色葡萄球菌前噬菌体的PT1028ORF001基因进行生物信息学分析,并进行原核表达,为金黄色葡萄球菌前噬菌体基因的功能研究提供参考数据。[方法]将金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌株功能未知的基因通过BLAST比对,从中发现了一个噬菌体PT1028的基因序列,将该基因命名为PT1028ORF001。使用Protparam、Prot Comp9. 0、NCBI保守结构域数据库、TMpred、Net Phos 3. 1 Server、PSIPRED、SWISS-MODEL等在线生物信息软件,分析PT1028ORF001蛋白的理化性质、亚细胞定位、保守结构域、跨膜区域、磷酸化修饰位点、二级结构和三维结构。用自行设计的引物扩增PT1028ORF001基因,扩增产物经酶切回收后与原核表达载体p ET-32a相连接,构建重组表达质粒,将该重组质粒转化E. coli TG1内,经菌落PCR鉴定后,增菌培养并提取质粒,再转化E. coli BL21 (DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测分析。[结果]PT1028ORF001蛋白由569个氨基酸组成,相对分子质量为64 671. 34 Da,等电点为8. 07,负电荷氨基酸残基总数为71个,正电荷氨基酸总数为73个,分子式:C2894H4530N762O885S16,原子总数9087个,是一种稳定的亲水蛋白质,定位于细胞膜上,与功能未知的DUF927蛋白超家族具有高度同源性,第202-223、240-258位氨基酸分别形成一个典型的跨膜区,潜在的磷酸化修饰位点共71个,二级结构中ɑ螺旋占比最高(40. 60%),其次是无规则卷曲(39. 89%),三维空间结构与二级结构预测结果相符。成功构建了表达载体p ET-32a(+)-PT1028ORF001,经IPTG诱导后重组蛋白获得了表达,蛋白相对分子质量为82. 4 k Da。[结论]PT1028ORF001基因的生物信息学分析结果以及该基因的成功克隆与表达,为深入研究该蛋白及其他金黄色葡萄球菌前噬菌体基因的功能奠定了一定基础。

对抗菌肽Cec4进行结构改造,并评估优化小肽的稳定性及溶血性。[方法]采用序列截短、氨基酸替换的方式来改造Cec4。采用微量稀释法,检测改造后的Cec4对各类鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度(MIC)。绘制时间-杀菌曲线,并评估不同因素对抗菌肽抑菌活性的影响,最后通过溶血实验检测其安全性。[结果]①截短后的Cec4失去抑菌效果。②Cec4氨基酸替换后的Cec4-1、Cec4-2未能提升抑菌能力。Cec4-4的MIC值为Cec4的50%。③在24h,时间-杀菌曲线显示,Cec4-4的抑菌活性较Cec4高30%。④血清会影响抗菌肽活性,并且高浓度胰蛋白酶(1. 0 mg/m L)会抑制Cec4-4抗菌活性。⑤溶血实验表明Cec4-4在1 mg/m L浓度下无溶血反应。[结论]截短使Cec4失去抑菌活性,氨基酸替换后的Cec4-4对各测试菌的抑菌活性较母肽提升了1倍,且抗菌肽在1mg/m L浓度下对人体无溶血反应。

探究从羊肚菌发酵液中提取胞外多糖的最佳工艺。[方法]实验原料为羊肚菌发酵液,采用单因素实验的方法探究在不同醇沉浓度、醇沉温度、醇沉时间、醇沉p H的条件下,运用正交实验分析从羊肚菌发酵液中提取多糖的最佳工艺条件;根据实验结果,提取7 d中羊肚菌胞外多糖,分别绘制多糖变化曲线和菌丝体生物量曲线。[结果]通过对羊肚菌胞外多糖提取的研究得到最佳工艺条件为:醇沉浓度95%,醇沉温度-25℃,醇沉时间24 h,醇沉p H 7。[结论]利用优化后的实验条件得出,羊肚菌胞外多糖含量最高为0. 874 g/L,在一定程度上为羊肚菌胞外多糖的研究提供了依据,具有十分重要的意义。

筛选高产抑菌活性物质的乳酸菌菌株,并研究抑菌物质的生物学特性。[方法]采用平板琼脂孔扩散法从发酵制品中筛选出具有抑菌活性的菌株,并对其进行形态学特征、生理生化特征及16S r DNA序列分析鉴定,测定抑菌谱,考察发酵产物对p H、温度、5种常见蛋白酶的敏感性。[结果]该菌株被鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),其发酵产物对细菌有抑制作用,对霉菌和酵母菌无抑制作用; p H 2. 0时发酵液抑菌圈直径达到21. 24±0. 45 mm,比p H 6. 0时高32. 7%;经沸水浴后原始发酵液抑菌圈直径下降了34. 3%,p H 2. 0时仅下降6. 9%;经蛋白酶处理后抑菌圈直径与对照组相比变化不大。[结论]筛选得到的乳酸菌菌株具有良好的抑菌活性,该抑菌物质在酸性条件下有较高的抑菌活性和热稳定性,对5种蛋白酶不敏感。

探讨曝光时间、洗脱时间等参数对蛋白免疫印迹法结果的影响。[方法]通过测量灰度值,比较不同曝光时间(6 s和21 s)、洗脱时间(30 min和8 h)以及图像处理软件(Image J和Imagequant TL)对蛋白免疫印迹法结果的影响。[结果]上样量比值为2∶1的蛋白曝光6 s的灰度值读数分别为14766±724和7171±577(n=3),均数比值为2. 1∶1。延长曝光至21 s后相同样品灰度值分别为14932±1198和11994±616(n=3),均数比值减小为1. 2∶1;洗脱30 min和8 h后的曝光结果相比,上样量为1. 64μg蛋白灰度值分别为23713±1895和22892±571(n=3),差异无统计学意义; Image J和Imagequant TL两种软件对倍比梯度上样的蛋白样品读值,比值分别为1∶0. 56∶0. 41∶0. 22和1∶0. 59∶0. 40∶0. 15;对两组读值进行直线回归分析,可得斜率分别为0. 13和0. 14,提示两组读值趋势一致。[结论]曝光时间对蛋白免疫印迹法结果有明显影响,高丰度蛋白需要低曝光时间,才能保持确切的倍比关系;洗脱时间超过30 min对蛋白免疫印迹法灰度值结果没有直接影响;不同图像处理软件对灰度值结果分析趋势一致。

将流式细胞术染色方法进行改良用于T细胞膜质蛋白共定位的共聚焦显微镜检测,在共定位表达于细胞膜上的CD4和细胞质内表达的TIPE2蛋白较常规镜检免疫荧光染色法可提高实验效率。[方法]取小鼠脾脏T细胞,用流式细胞术的染色方法代替实验室常规免疫染色法,对细胞膜上的CD4与细胞质内的TIPE2蛋白进行染色,制片并在激光共聚焦显微镜下观察。[结果]小鼠脾脏CD4+T细胞上出现了TIPE2蛋白的共表达,符合实验预期,同时实验效率从原有10%提高到90%。[结论]采用该染色方法后突破了常规免疫荧光染色必须要在载玻片上进行的局限,简化了操作,保证了实验的有效性,提高实验效率。

探索应用pIRES2-EGFP表达载体快速建立Hela细胞稳转细胞系的筛选方法。[方法]EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切,T4 DNA连接酶连接构建目的基因p IRES2-EGFP表达载体并测序确定,Lipofectamine3000转染Hela细胞分为Mock组(未转染组)、NC组(p IRES2-EGFP空载对照组)、重组质粒转染组,转染后24 h消化细胞进行初步筛选(900μg/m LG418),转染后14～16 d将长至肉眼可见的细胞克隆全部重新消化进行二次筛选(方法同初步筛选),转染后28～32 d挑选3个肉眼可见的细胞克隆,实时荧光定量PCR和WB检测目的基因过表达效率。[结果]双酶切及测序确定重组质粒成功构建,与Mock组相比,NC组无明显变化,重组质粒转染组各克隆目的基因mRNA水平分别升高109±8. 3、127±10. 5、122±9. 1倍,P <0. 01,蛋白水平分别升高33±3. 3、45±4. 7、47±4. 9倍,P <0. 01。[结论]该筛选方法 28～32d左右可快速建立Hela细胞稳转细胞系,过表达效率高,可直接进行后续实验。

构建人Smurf1基因的真核表达载体并检测其表达和细胞亚定位。[方法]PCR法从人胚肾细胞HEK-293T中扩增Smurf1基因的ORF序列,将其插入到带Flag标签的p CMV5真核表达载体,插入位点为限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间。酶切并测序鉴定该质粒的正确性。将成功构建的质粒Flag-Smurf1转染HEK-293T细胞和Hela细胞,Western Blotting检测Smurf1蛋白的表达情况;转染Mv. 1. Lu细胞,免疫荧光检测Smurf1蛋白在细胞中的亚定位。[结果]成功扩增出Smurf1基因的ORF序列;连入p CMV5中获得了质粒Flag-Smurf1;酶切鉴定得到2. 2 kb大小的片段,测序结果显示连入的是Smurf1基因的c DNA序列正确。Western Blotting结果显示该质粒可在HEK-293T细胞和Hela细胞中表达,表达大小约为80 k Da,符合预期。免疫荧光实验结果显示过表达的Smurf1主要定位在细胞膜上。[结论]成功构建了带Flag标签的人Smurf1基因的真核表达质粒,该质粒可在细胞中顺利表达。

随着人体肠道菌群研究的不断深入,菌群的结构、功能被发现与人类的多种疾病之间存在显著的关联。除遗传因素外,生活方式及饮食习惯可以在很大程度上改变人体肠道菌群的稳态平衡,因此通过饮食干预调节肠道菌群,从而改善人体健康状况将是未来的研究热点之一。该文对疾病状态下肠道菌群种类和丰度的变化进行了总结,综述了饮食调节对肠道菌群的影响及反馈作用的研究进展,以期为今后通过饮食干预的方式改善人类健康状况的个性化精准医疗提供参考。

大多数农药具有较高的土壤持久性和对非目标物种的毒性,农药残留污染已成为人们日益关注的问题。作物中农药残留会对人体造成伤害,有效降低农药残留对保证食品安全至关重要。该文从植物根际促生微生物(Plant Growth Promoting Rhizo-microorganisms,PGPR)的概述、PGPR对土壤及农药残留等方面的作用和实际应用等方面,系统阐述了PGPR提高作物抗性的作用机理、降低作物中农药残留、防治农药污染、提高地力及土壤修复的研究进展。并对目前PGPR存在的问题、解决的方法及研究的方向进行了展望。

具有自养代谢能力的微生物将无机碳同化为有机碳,使其他生物无法获得的碳成为全球碳循环的核心组成部分。在现存生物圈中,卡尔文-本森循环是许多原核生物和所有植物将CO2固定到生物量中的主要代谢机制,然而却忽视了原核生物中的其它5种自养代谢途径。对其他自养代谢途径的研究发现,这5种途径均以乙酰-Co A为中心将CO2同化为生命所需的有机物。该文从分子水平上系统阐述了六种自养代谢途径的CO2固定机理并对CO2的固定对自然界的作用进行展望。

比较单独及混合胶原酶消化小鼠乳腺癌移植瘤组织后获取的细胞活性。[方法]用4T1细胞建立小鼠乳腺癌动物模型,待成瘤后取乳腺癌肿瘤组织。比较4种消化酶(Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅰ+Ⅳ型混合胶原酶和商用胶原酶),两种消化方法:单酶或多酶单次消化30 min;单酶或多酶分次消化30 min。用碘化丙啶(PI)染色各组消化后的细胞悬液,流式细胞仪检测细胞活率。[结果]不同酶单次消化后的细胞活率分别为:Ⅰ型胶原酶为55. 5±7. 2%、Ⅳ型胶原酶为26. 9±7. 6%、Ⅰ+Ⅳ型混合胶原酶为43. 5±10%、商用胶原酶为30. 4±10. 6%;在分次消化后分别为:Ⅰ型胶原酶为70. 6±4. 1%、Ⅳ型胶原酶为65. 5±17. 2%,Ⅰ+Ⅳ型混合胶原酶为78. 3±2. 2%,商用胶原酶为48. 5±11. 6%。[结论]使用Ⅰ+Ⅳ型混合胶原酶分次消化得到的乳腺癌移植瘤细胞活性最高,并为小鼠乳腺癌移植瘤组织消化提供了一种有效的新方法。

旨在发现胱硫醚β合酶（Cystathionineβ-synthase,CBS）的新型抑制剂并研究其作用机制。[方法]通过构建血红素结合位点缺失或氧化还原位点突变的CBS突变体(CBS70-413和CBS C272A/C275A),基于该酶的测活方法和PLP荧光光谱分析,研究3个CBS新型抑制剂的抑制有效性及其分子作用机制。[结果]亲和纯化得到了有活性的CBS70-413和CBS C272A/C275A突变蛋白以用于抑制剂的机制研究。研究发现,CBS70-413突变体可高效拮抗这些抑制剂的抑制效果,而C272A/C275A突变则不行,提示这些抑制剂可与该酶的血红素结合位点结合而抑制该酶活力。进一步研究结果表明,它们可别构调控该酶辅基PLP的含量。[结论]3个抑制剂的分子作用机制为,通过与该酶的Heme位点结合,并通过该位点去别构调控PLP辅基与活力位点的结合,从而抑制该酶的活力。

探讨线粒体基因orf290主要功能结构域与水稻配子体细胞质雄性不育的关系。[方法]利用生物信息学方法,分析ORF290功能结构域,构建其不同功能结构域的表达载体,完成遗传转化,采用碘-碘化钾染色法观察阳性植株的花粉育性及小穗育性,统计分析ORF290功能结构域与育性的关系。[结果]与保持系相比,各功能结构域的转基因植株农艺性状的差异不明显,花粉育性及自然结实率均有所降低,35S::orf290（T0代）、35S::Rf1b 5'-orf290（T1代）、35S::Rf1b 5'-orf216（T0代）和35S::orf216（T0代）花粉育性（结实率）分别为:50. 7%（46. 5%）、33%（42. 15%）、38. 7%（37. 9%）和60. 8%（50%）。[结论]结果表明orf290是细胞质雄性不育相关基因,且ORF290功能结构域位于C端,N端具有线粒体定位信号。

构建大肠杆菌整合宿主因子两亚基的共表达载体并对其表达纯化条件进行探索。[方法]PCR扩增himA和hip基因,重叠PCR连接起来后利用重组酶连接到表达载体p ET-duet1中,筛选阳性重组子,转化Rosetta（DE3）表达菌,调整诱导时IPTG的浓度及诱导时间,确定最佳诱导条件,最后通过himA基因C端的6×His标签与镍的结合,进行蛋白纯化。[结果]成功扩增himA和hip基因;重组表达载体p ET-duet-himAhip经PCR和DNA测序鉴定构建成功; SDS-PAGE检测到大小约为11. 1 k Da和10. 7 k Da的目的蛋白,IHF的表达成功; 37℃,A600=0. 6～0. 8时,在IPTG终浓度分别为0. 2 mmol/L、0. 5 mmol/L条件下诱导2 h、4 h,目的蛋白的表达量没有明显区别。[结论]成功构建IHF两个亚基的共表达载体,在37℃诱导条件下简单快速得到等比例的可溶性IHF-α和IHF-β,为后续研究奠定基础。

克隆、表达金黄色葡萄球菌ymd B基因,并对其编码产物进行生物信息学分析。[方法]以金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌株的基因组DNA为模板,用聚合酶链式反应扩增ymd B基因,将扩增基因酶切后与表达载体pET-32a(+)连接,构建重组质粒并转化大肠杆菌TG1,增菌培养后提取质粒,经PCR、基因测序鉴定后,再转化大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株进行诱导后,进行10%SDS-PAGE分析。使用Protparam、PSORT、CDD、Signal P 4. 1、TMpred、Net Phos 3. 1 Server、PSIPRED、SWISS-MODEL等软件,分析YmdB蛋白的氨基酸数目、相对分子质量、理论等电点、带电荷氨基酸总数、半衰期、稳定性、疏水性、亚细胞定位、保守结构域、信号肽、跨膜区、磷酸化位点、二级结构、三维结构等。[结果]构建了表达载体pET-32a(+)-ymd B,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得表达。YmdB蛋白由266个氨基酸组成,相对分子质量为30134. 53Da,等电点为6. 23,正电荷氨基酸总数为33个,负电荷氨基酸总数为35个,在大肠杆菌内的半衰期为10 h以上,是稳定的亲水蛋白质,定位于细胞质中,与YmdB蛋白家族具有相似的保守结构域,没有信号肽,有一个跨膜区和14个磷酸化位点,二级结构中ɑ螺旋、β折叠和无规则卷曲分别占42. 11%、9. 40%、48. 49%,三维空间结构与二级结构预测结果大致相同。[结论]成功克隆、表达了金黄色葡萄球菌ymdB基因,并对YmdB蛋白进行了生物信息学分析,为深入研究该蛋白的分子作用机理打下一定基础。

分离鉴定江苏邳州地区霉腐蒜头的致病真菌,为防控该地区蒜头腐败,延长蒜头贮藏期提供理论指导。[方法]对江苏邳州霉腐大蒜的腐败真菌采用点接法培养分离纯化,科赫氏法则和粘片法对蒜头霉腐微生物菌落形态、菌丝显微结构进行观察,并进行分子生物学鉴定。[结果]分离得到7株菌株,确定病原菌A为芽枝霉菌(Cladosporium cladosporioides),B为黑霉菌(Cladosporium cladosporioide),C为鲜绿青霉菌(Penicillium verrucosum),D为白腐菌(Trametes versicolor),E、G为芽枝状枝孢霉菌(Cladosporium cladosporioide),F为青霉菌(Penicillium chrysogenum),H为烟曲霉菌(Aspergillus funigatus)。[结论]导致江苏邳州地区大蒜霉腐的真菌主要是芽枝霉菌(Cladosporium cladosporioides)、黑霉菌(Cladosporium cladosporioide)、鲜绿青霉菌(Penicillium verrucosum)、白腐菌(Trametes versicolor)、芽枝状枝孢霉菌(Cladosporium cladosporioide)、青霉菌(Penicillium chrysogenum)、烟曲霉菌(Aspergillus funigatus)。