药品的微生物限度检查是药品安全性检验的重要指标之一，2020年版《中国药典》（四部）中提到建立药品的微生物限度检查法所选方法的适用性须经确认。为此课题组参照《中国药典》2020年版（四部）通则1105、1106非无菌产品微生物限度检查、控制菌检查法中的标准[1]，对两种复方油脂类医院制剂鼻软膏（含磺胺嘧啶、硼酸，辅料为樟脑、薄荷油、液状石蜡油、白凡士林）、鱼肝油软膏（含鱼肝油，辅料为白凡士林）的微生物限度检查方法进行优化，将较为复杂的乳化剂（5g司盘80、3g单硬脂酸甘油脂、10g聚山梨脂80）优化为十四烷酸异丙酯作为乳化剂，并进行了方法适用性验证试验，优选出适宜该两种制剂的微生物限度检查方法，确保了验证结果的可靠性及操作的简便性。
1 仪器、材料
1.1仪器
压力蒸汽灭菌器（LDZX-50KBS型，上海申安医疗器械厂）、霉菌培养箱（MJ-250-I型，上海一恒科技有限公司）、隔水式恒温培养箱（9160型，海一恒科技有限公司）、干燥箱（101-2型，中华人民共和国上海市实验仪器总厂）电热恒温水温箱（S648，上海医疗器械七厂）。
1.2样品
鼻软膏、鱼肝油软膏两种试验样品均为本院制剂室生产，每种制剂品种均取样 3个批号，每个批号取2个最小包装。
1.3试验菌株
铜绿假单胞菌181108、金黄色葡萄球菌 181025、枯草芽孢杆菌181110、黑曲霉菌181102、白色念珠菌181026、大肠埃希菌 181107。以上试验菌株含量范围500～1000cfu/颗，传代次数为4代，生产单位均为北京三药科技开发公司。
1.4培养基、稀释液及试剂
胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基，以上培养基生产单位均为广东环凯微生物科技有限公司；0.9%氯化钠溶液（四川拜伦药业股份有限公司）；十四烷酸异丙酯（广东环凯微生物科技有限公司）。
2方法
参照2020年版《中国药典》（四部）通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、1106控制菌检查法进行验证试验。两种制剂分别进行3次独立的平行试验，分别计算各次试验的回收比值。
2.1菌液制备
按菌株产品使用说明书：临用前用复溶液制备成每1 mL含菌数为50-100cfu的菌悬液和孢子菌液。
2.2供试液制备
鱼肝油软膏5g加乳化剂无菌十四烷酸异丙酯5ml，缓慢加入45℃的无菌氯化钠溶液至100ml，边加边搅拌，使充分乳化，得1：20供试液；鼻软膏10g加乳化剂无菌十四烷酸异丙酯10ml，加入中和剂无菌1%对氨基苯甲酸溶液10ml[2]，缓慢加入45℃的无菌氯化钠溶液至100ml，边加边搅拌，使充分乳化，得1：10供试液。乳化剂和稀释剂已做对照组试验。
2.3验证试验
2.3.1需氧菌总数计数方法适用性试验：均采用平皿法，依法[3]进行3组试验，①试验组：取2.2项下制备的供试液 1mL和2.1项下制备的菌液，分别注入平皿中，倾入胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定菌数；②菌液组：取2.1项下制备的菌液，方法同①；③供试品对照组：取2.2项下制备的供试液，方法同①。
2.3.2霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验：均采用平皿法，依法[4]进行3组试验，①试验组：取2.2项下制备的供试液 1mL和2.1项下制备的菌液，分别注入平皿中，倾入沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定菌数；②菌液组：取2.1项下制备的菌液，方法同①；③供试品对照组：取2.2项下制备的供试液，方法同①。
2.3.3计算公式：（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数计算回收比值。
2.3.4控制菌检查法适用性试验：依法[5]同时进行两组试验，试验组：取2.2项下制备的供试液10mL和 2.1项下制备的菌液加入增菌培养基中，根据相应控制菌检查法检查，应检出试验菌；阴性对照组不得检出试验菌。鱼肝油软膏不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌；鼻软膏不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、大肠埃希菌。
3 结果
3.1计数方法适用性试验结果
3.1.1需氧菌验证回收比值
两种医院制剂的需氧菌验证回收比值结果见表1。由表1实验数据可知：需氧菌回收比值在0.5～2之间，符合药典规定。
表 1 需氧菌验证回收比值
3.1.2霉菌和酵母菌验证回收比值
两种医院制剂霉菌和酵母菌回收比值见表2。由表2实验数据可知：霉菌和酵母菌回收比值在0.5～2范围内，符合药典规定。
表 2 霉菌和酵母菌验证回收比值
3.2控制菌检查法适用性试验结果
两种医院制剂控制菌检查验证结果见表3。由表中实验数据可知，阳性对照均检出控制菌，阴性对照组均未检出控制菌，两种医院制剂的试验组均检出了相应的控制菌。
表3 控制菌检查验证结果
注：“+”代表控制菌被检出，“-”代表控制菌未被检出，“/”代表无需检测
4讨论
根据3.1计数方法适用性试验结果得知，需氧菌、霉菌和酵母菌回收比值均在药典规定的0.5～2的范围内，3.2控制菌检查法适用性试验结果显示控制菌均能按照药典方法检出。本课题组将两种复方油脂类医院制剂微生物限度检查方法进行优化，将原来较为复杂的乳化剂（5g司盘80、3g单硬脂酸甘油脂、10g聚山梨脂80）优化为单一的十四烷酸异丙酯作为乳化剂，优选出适宜该两种制剂的微生物限度检查方法，鱼肝油软膏采用常规平皿法,鼻软膏采用1%对氨基苯甲酸溶液中和平皿法，通过方法验证实验从而保证结果的准确性和可靠性。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)[S].2020年版.北京：中国医药科技出版社，2020：通则1105-1107.
[2] 韦曦，邱双成，王翠荣.29种医院制剂微生物限度检查方法验证[J].中国药房，2008，19（1）：52-54.
作者简介：许盈，硕士研究生，副主任药师。研究方向：医院药学，药品检验。E-mail：34654561@qq.com
