Abstract Objective To evaluate the efficacy of basic fibroblast growth factor (bFGF) hydrogel in promoting alveolar bone repair in rats.Materials and Methods Rats aged 6-8 weeks were anesthetized, and a moderate periodontitis model was established using a ligature wire method. The bFGF gel preparation was circumferentially injected into the periodontal pockets between the left maxillary first and second molars, while the right side was implanted with a gel matrix without bFGF as a control. The animals were sacrificed 8 weeks after administration, and the therapeutic effects were evaluated by Micro-CT and histological measurements.Results Compared with the control group, the bFGF hydrogel group showed statistically significant differences in new bone formation, bone mineral density, and other parameters (P<.05).Conclusion This study demonstrates that bFGF hydrogel effectively promotes new bone formation and increases bone mineral density in a rat model of periodontitis. These findings indicate that bFGF hydrogel can facilitate alveolar bone repair, holding promising potential for future applications in the field of periodontal tissue engineering.
1 前言
牙周炎是一种慢性感染性口腔疾病，在国际上患病率较高，是导致牙齿脱落的主要原因[1-2]，牙周炎患者临床表现为牙周韧带和牙槽骨的病理性丧失。目前，牙周炎治疗的常见方法是洗牙和根面平整以去除牙龈上方和下方的牙菌斑和牙周袋。然而，该治疗方法只会延迟局部炎症的进展并无法恢复丢失的牙齿支撑组织。牙周治疗的最终目标是丢失的牙周组织实现再生。为此目的，一些牙周再生技术与骨替代品，引导组织再生（GTR）膜和牙釉质基质衍生物，已经被开发出来，以确保再生空间和/或激活牙周再生。然而，这些治疗方法的成功与否取决于外科医生的技能和组织损伤的严重程度。因此，对严重牙周炎的有效和功能再生的医疗需求仍然很高。
成纤维细胞生长因子（FGFs）是一组促进成纤维细胞增殖的蛋白质，发现于大脑和垂体组织中，这个蛋白家族包括FGF-1到FGF-23[3]。FGFs通过旁分泌或内分泌分泌，参与重要的病理生理过程，如血管生成、伤口愈合、胚胎发育和内分泌分泌调节[4-8]。其中，碱性成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）是一种众所周知的促进血管生成的生长因子[9]，诱导多种细胞的增殖生成，包括成纤维细胞、血管内皮细胞、神经外胚层系统细胞、成骨细胞、软骨细胞、血管平滑肌细胞和上皮细胞。此外，bFGF还能强烈诱导间充质细胞的增殖和迁移，负责牙槽骨再生的PDL和牙骨质[10-16]。
在本项研究中为了揭示bFGF凝胶剂在牙周组织再生中的作用效果，我们将bFGF制备成水凝胶制剂，采用大鼠手术构建中度牙周炎模型，在给药8周后处死动物取材，采用Micro-CT和组织学测量评估bFGF水凝胶对缺损再生的效果。
2 材料与方法
2.1 主要试剂及仪器
蔗糖、甘氨酸、肝素钠、羟丙基纤维素、rh-bFGF、阿佛丁（北京唐木浩扬生物科技有限公司）、切片机、显微镜、Micro-CT
2.2 实验动物
20只健康的6~8周龄雌性Sprague Dawley大鼠，无特定病原体（specefic pathogen free,SPF）级，体重为200~300g，牙列完整，牙周组织健康，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（京）2024-0001，饲养于北京口腔医院研究所动物室，实验动物使用许可证号为SYXK（京）2018-0020，实验动物质量控制及饲养环境均符合国家相关标准规定。
2.3 bFGF水凝胶制备
4 mg/mL bFGF的母液用含2%蔗糖、1%甘氨酸、1%肝素钠的溶液配置成含0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml bFGF溶液后过滤除菌后溶解于高温湿热灭菌的3%羟丙基纤维素（HPC）溶液中，搅拌均匀制备出0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的bFGF水凝胶，阴性对照为不含bFGF的水凝胶基质溶液。
2.4 大鼠牙周炎模型的建立
大鼠称重记录后，经腹腔注射阿佛丁（1ml/100g）麻醉，待麻醉起效后对大鼠进行口腔消毒，采用结扎丝法在大鼠上构建中度牙周炎模型，以模拟临床中由牙周炎引起的牙槽骨缺损，用牙科探针分离第一、二磨牙牙间间隙，使用直径为0.2mm的正畸不锈钢丝结扎大鼠双侧上颌第一磨牙牙颈部，用持针器夹持结扎丝从大鼠上颌双侧第一磨牙远中腭侧进入，环绕上颌第一磨牙一周后，在腭侧偏近中处结扎固定，结扎丝末端保留3mm回弯置于龈下，防止结扎丝划伤口腔内软组织，且不损伤牙龈的结合上皮。术后严密观察大鼠的状态，从实验当天起喂食糖水，12小时后进食，每天高糖饮食喂养（饮用水为10%葡萄糖水，饲料为10%葡萄糖水浸泡变软的常规饲料）。术后每周检查牙周结扎情况，并观察牙周组织的状况。
术后4周随机处死2只大鼠，解剖得到上颌骨。通过：（1）Micro-CT检测垂直向骨缺损存在并累及分叉；（2）确定是否诱发炎症；初步确定构建由牙周炎引起的牙槽骨缺失所需的时间，判定是否成功构建牙槽骨缺损的大鼠牙周炎模型。
A、B、C：结扎丝线；D、E、F：结扎正畸丝
图1大鼠造模流程(Figure1 The process of rat modeling)
2.5 bFGF制剂回植
随机选取建模成功的大鼠18只，称重记录后随机分为三组，为低（0.5mg/ml）、中（1mg/ml）、高剂量（2mg/ml）bFGF制剂回植组。大鼠经腹腔注射阿佛丁（1ml/100g）麻醉后进行口腔消毒，随后使用超声清洁器清洁左右侧上颌第一磨牙与第二磨牙，清洗干燥后于左侧上颌第一磨牙与第二磨牙牙周袋内环绕注射bFGF制剂，右侧回植不含bFGF的溶剂。
2.6 组织样本制备及骨改建的观察
每组于术后8周时，分别安乐处死3只大鼠，解剖、分离得到上颌骨样本，置于10%福尔马林固定保存。利用Micro-CT扫描并分析牙周炎骨缺损位点修复情况，扫描参数为70kV，100μA，扫描层厚7μm，扫描结束后利用配套软件进行三维图像重建。对缺损位点组织进行骨体积分数（BMD）、组织内骨量占比（BV\TV）及其他骨改建指标（如BS、TV、BV、St.th、St.Li、St.Sp等）的分析和定量。
2.7 组织学分析
Micro-CT扫描重建分析完成后的大鼠上颌样本，采用10%甲酸充分脱钙，脱钙后制作石蜡切片，切片用苏木精-伊红（HE）染色来分析新骨的形成和用Masson染色进一步分析胶原蛋白的形成，并用显微镜拍摄图像。
2.8 统计分析
计算每次测量的平均值和标准差（SD），并采用t检验分析每组之间的差异，显著性水平设为5%。使用SPSS软件和SAS软件进行统计分析。
3 结果
3.1 新生骨的微观结构分析
利用Micro-CT图像分析给药8周时模型中新形成骨的体积和骨密度，以评估牙槽骨重建水平。测量对照组与bFGF组之间的选定区组织体积（TV）和新生骨体积（BV），计算新生骨体积分数（BV/TV），统计结果显示bFGF给药组骨密度、骨体积分数显著高于基质组（见表1和图2）。
注：*P<.05,**P <.01,***P <.001.
表1 Micro-CT图像分析结果统计表（Mean±SD)(Table 1 Statistical table of Micro-CT image analysis results (Mean ± SD))
图2 Micro-CT分析结果(Figure 2 Micro-CT analysis results)
结果可知，给予牙周炎模型大鼠低（0.5mg/ml）、中（1mg/ml）、高剂量（2mg/ml）bFGF制剂后8W，Micro-CT结果显示中、高剂量可显著提高大鼠牙槽骨密度及新生骨体积分数。
3.2 组织病理分析
各给药组的HE和masson染色结果见下图3。基质组镜下可见牙龈组织炎症明显，结合上皮附着丧失，部分区域牙周袋壁上皮溃疡形成，固有层大量炎细胞浸润，牙周膜纤维排列紊乱，第1、2磨牙间牙槽嵴和根分叉处可见明显骨吸收。bFGF给药组牙周炎大鼠的牙槽骨破坏程度得到一定程度的控制，根分叉骨形成明显，第1、2磨牙间牙槽骨高度和厚度较牙周炎组高，其中以2mg/ml组大鼠为最轻。
图3 组织病理染色(Figure 3 Tissue pathological staining)
上述研究结果表明，组织病理学结果显示人bFGF对被破坏的牙周组织以及被吸收的牙槽骨的修复具有显著的促进作用，且其治疗效果存在剂量依赖关系。
综上所述，这些结果表明，在骨密度、基质和结缔组织附着方面，bFGF给药侧增强了牙周组织的再生，其质量与正常生理愈合过程所产生的质量相同。
4 讨论
本项研究中，我们采用正畸丝结扎的方法制造了大鼠牙周炎模型，探讨局部应用bFGF会否促进牙槽骨缺损修复及牙周再生。从研究结果来看，将bFGF局部应用于这些缺损确实会显著诱导牙周再生，促进缺损组织的修复，刺激新骨生成。且在整个实验期间，未观察到给药部位有严重的炎症或肿胀，动物亦未见任何不良反应。
日本已有上市产品REGROTH，结合牙周翻瓣技术治疗牙周炎引起的牙槽骨缺损。但该产品仅在日本销售，且因为翻瓣需要专业医师及仪器设备方能进行，成本费用也相当高，不利于普惠百姓大众。如若能开发直接用于牙周袋内给药方式的bFGF药物，降低成本，应更能符合大众的接受治疗的依从性。在这项研究中，我们初步验证了 牙周袋内给予bFGF 对大鼠牙周再生的疗效，研究结果显示，bFGF能够有效地促进牙槽骨的再生，增加牙槽骨的高度和密度 。与对照组相比，接受bFGF治疗的实验组牙槽骨缺损处有更多的新骨形成，骨小梁排列更加规整，牙周膜纤维也能够更好地附着于新生骨组织上，实现了牙周组织的功能性重建 。然而，由于本研究中采用牙齿结扎丝方法构建的急性骨缺损，其缺乏炎性诱导过程，与人类牙周炎引起的牙槽骨缺损病因学不匹配。因此，要证实bFGF疗法对人类牙周炎模型的骨缺损修复的有效性，一方面需要开发一种具有重复性、可定量性，易于管理的模拟人牙周炎的动物模型，进一步的研究有炎症微环境下局部应用bFGF对动物牙周炎骨缺损的有效性。另一方面要研究 bFGF 的有效剂量、治疗剂量和安全性。此外，本研究中采用的HPC作为药物载体递送药物，实现缓释的作用微弱，体外释放结果显示bFGF/HPC凝胶2h释放50%，8h内基本释放完全，如果可以产生比HPC更理想的载体为未分化的间充质细胞提供较长时间（14d以上）药物递送，或具有骨传导的支架作为载体，那么bFGF应用于骨缺损修复效果更佳，未来还可以对其他类型的骨缺损进一步探索。
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