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CD36原核表达载体的构建及生物信息学分析 下载：73 浏览：498
摘要:
对CD36基因进行体外克隆表达,建立CD36基因cDNA在大肠杆菌中表达的实验技术以及进行CD36蛋白三级结构的预测并利用生物信息学方法进行分析。[方法]以人血液RNA为模板,RT-PCR扩增CD36的基因序列;并构建原核表达质粒pET-32a-CD36转化到大肠杆菌DE3中后,经过IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE验证。[结果]成功克隆了人CD36基因并构建出原核表达质粒,成功转入表达菌大肠杆菌DE3中后经IPTG诱导成功表达,且在1 mmol/L的诱导剂浓度下培养6 h表达量最佳。利用Phyre2和Abcpred软件预测蛋白质结构和B细胞抗原表位,B细胞抗原表位评分大于0.85的CD36的B细胞抗原表位有8个。[结论]成功建立了人CD36基因的原核表达的实验技术,并对CD36的结构及B细胞抗原表位进行了预测,为后续研究CD36基因的功能和抗体制备提供方向和奠定基础。
产(R)-1,3-丁二醇的工程菌构建及转化条件研究 下载：81 浏览：500
摘要:
利用重组大肠杆菌实现(R)-1,3-丁二醇的生物合成。[方法]从脱硫球菌(Desulfococcus biacutus)中克隆得到羰基还原酶基因DbCR,构建pET28a-DbCR表达载体并在大肠杆菌E.coli BL21中表达,利用气相色谱对反应液进行检测。[结果]DbCR在pH 7.5、35℃的最适条件下的酶活力为4.5 U/mL。在50 mL全细胞反应体系中,重组工程菌在pH 7.5、30℃条件下,反应48 h时,对300 mmol/L底物4-羟基-2-丁酮的转化率> 96%,产物(R)-1,3-丁二醇的e.e.值> 99%。[结论]构建得到高效催化合成(R)-1,3-丁二醇的工程菌,工程菌对底物的转化率>96%,产物纯度> 99%。
胞浆接头蛋白Dok5的表达及生物信息学分析 下载：67 浏览：499
摘要:
构建携带小鼠Dok5基因及其PH、PTB结构域的原核表达载体,并表达对应GST融合蛋白。[方法]从小鼠脑组织提取总RNA,逆转录后经PCR扩增、酶切、连接及转化大肠杆菌DH5α,构建携带Dok5全长(FL)、PTB、PH结构域的原核表达质粒,经酶切及测序鉴定之后,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达蛋白,再利用Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化得到融合蛋白,并通过Western Blotting检测其与相应抗体的反应性。利用生物信息学相关软件(ClustalW2、ProtParam、ProtScale、NetPhos 2.0 Server、SOPMA、Swissmodel)预测Dok5蛋白的理化性质和磷酸化位点以及二、三级结构。[结果]构建了小鼠Dok5 FL、PH、PTB的原核表达质粒,并得到了浓度分别为0.3 mg/ml、0.6 mg/mL、1 mg/mL的pGEX 6p-1-Dok5 FL、PH、PTB蛋白,其中Dok5 FL融合蛋白与相应抗体具有良好的反应性。Dok5长度为921 bp,编码306个氨基酸,在人、鼠、猴中高度保守。Dok5相对分子质量为35.453 kDa,理论pI为9.0,包含50个潜在磷酸化位点。[结论]分别得到了63 kDa、39 kDa、37 kDa的Dok5 FL、PH、PTB的GST融合蛋白,预测Dok5是一种亲水性的不稳定蛋白。
铜绿假单胞菌黏附素蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备 下载：71 浏览：484
摘要:
克隆铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)黏附素(adhesin)基因,表达纯化黏附素蛋白和获得多克隆抗体。[方法]设计特异性PCR引物,以铜绿假单胞菌DNA为模板,PCR法扩增铜绿假单胞菌黏附素基因,并将其进行双酶切后连接到表达载体pET28a,将重组质粒pET28a-adhesin转入大肠杆菌BL21,IPTG诱导目的蛋白表达,然后通过亲和层析进行纯化。再利用各种生物信息学软件分析该蛋白的生物学特性。将adhesin蛋白免疫小鼠,并获得了高浓度的多克隆抗体。[结果]显示成功得到了重组质粒pET28a-adhesin,并通过亲和层析得到重组adhesin蛋白。Adhesin的α-螺旋含量为46.37%,无规卷曲的含量为35.96%,β片层的含量为17.67%。模拟得到了adhesin蛋白的三级结构。该蛋白是一个跨膜蛋白,具有两个跨膜区。Adhesin蛋白具有良好的免疫原性,获得的抗血清效价高于1:5120。[结论]纯化得到了重组adhesin及其抗血清,为研究该蛋白的功能提供了实验基础。
Dhori病毒核蛋白基因的重组表达及其抗体制备 下载：82 浏览：493
摘要:
表达和纯化Dhori病毒(DHOV)核蛋白(NP),并制备多克隆抗体。[方法]RT-PCR扩增NP基因,并克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pcDNA3.1中。将重组质粒pET-28a-NP转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白NP(rNP)的表达并亲和层析纯化rNP,以抗DHOV阳性羊血清检测其抗原性,免疫新西兰兔制备抗血清,以ELISA法检测其效价。将pcDNA3.1-NP转染至Vero细胞,以间接免疫荧光法评估抗体的结合活性,Western Blotting检测抗体与重组蛋白的特异性反应能力。[结果]pET-28a-NP和pcDNA3.1-NP重组质粒构建正确,原核表达的rNP约为55.3 kDa,并能被阳性羊血清识别,制备的抗体效价为1:409 600,能特异性识别真核及原核表达产物。[结论]成功表达和纯化rNP,并制备了多克隆抗体,可用于深入研究DHOV核蛋白的生物学特性及其检测试剂。
