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缺铁应答基因FOX1上游调控基因的筛选 下载：81 浏览：514
摘要:
筛选与莱茵衣藻FOX1基因启动子结合的调控基因序列。[方法]利用酵母单杂交的方法,构建pHIS2.1-FOX1诱饵载体,并将其转入到酵母菌株Y187中,在SD/-Trp/-His/-Leu/50 mmol/L 3-AT筛选培养基上挑选酵母阳性转化子,PCR克隆阳性转化子的序列并测序,利用Blastx程序检索phytozome莱茵衣藻基因组数据库,获得阳性转化子序列的同源基因信息。[结果]18个酵母阳性转化子测序成功,其同源基因主要有CTR型铜离子转运体(CTR2)、核糖体蛋白,和参与光合作用、氧化还原反应和物质运输等方面的功能蛋白。[结论]利用酵母单杂交技术筛选到缺铁应答基因FOX1潜在的上游调控基因。
融合蛋白TCRαζβζ中CD3ζ分子与T细胞膜的共定位分析 下载：79 浏览：512
摘要:
构建融合CD3ζ的TCRαζβζ分子的双表达载体,并观察TCRαζβζ分子中的CD3ζ与细胞膜的共定位情况。[方法]设计重叠PCR引物,利用重叠PCR扩增携带荧光蛋白的融合基因TCRβζ-EYFP和TCRαζ,将其克隆到p IRES2-EGFP载体,构建双表达载体p IRES2-TCRβζ-EYFP/TCRαζ,将重组载体分别转染BEL-7402细胞和Jurkat T细胞,转染48 h后,细胞膜经Di D染料染色,共聚焦显微镜扫描并分析该TCRαζβζ分子的表达以及与细胞膜的共定位情况。[结果]重组双表达载体p IRES-TCRβζ-EYFP/TCRαζ经菌落PCR、酶切鉴定及测序分析证明载体构建成功;共聚焦显微镜扫描结果显示重组载体表达了融合蛋白TCRαζβζ分子;共定位程序分析显示TCRαζβζ分子中的CD3ζ与细胞膜存在共定位关系。[结论]成功构建了融合蛋白TCRαζβζ分子的双表达载体,TCRαζβζ分子中的CD3ζ与细胞膜存在共定位。
突变质粒CMV-3flag-hPROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)的构建及表达 下载：81 浏览：537
摘要:
构建CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)真核表达质粒并观察其蛋白表达。[方法]将NotⅠ的酶切位点(GCGGCCGCC)引入第一次PCR的后引物,扩增并突变h PROKR2的1-1035 bp(343YFK/AAA345),再将NotⅠ的酶切位点和3个连续甘氨酸突变碱基GCCGCCGCA引入第二次PCR的前引物扩增并突变h PROKR2的1036-1152bp(351HWR/AAA353),通过NotⅠ酶切位点连接前后两个片段,即可构建pc DNA3.1-h PROKR2-myc-his(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353),最后通过测序鉴定突变是否成功。扩增h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353),连接入CMV-3flag。Western Blot检测相应蛋白的表达。[结果]成功构建CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)质粒,并验证到相应蛋白表达。[结论]利用NotⅠ酶的碱基序列特性(GCGGCCGCC)进行3个连续氨基酸突变的方法简单有效。质粒CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)的成功构建为后期进一步实验创造条件。
苏云金芽胞杆菌cyt2Ba16基因的克隆表达 下载：481 浏览：507
摘要:
获得苏云金芽胞杆菌QL32-1中杀虫晶体蛋白基因,并分析其杀虫活性。[方法]采用cyt基因通用引物、两步法染色体步移的方法对QL32-1中cyt基因进行鉴定和全长克隆,再构建重组质粒pET-28a-2Ba16,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,最后对表达蛋白进行杀虫活性分析。[结果]克隆得到1个全长783 bp cyt2B基因,其编码260个氨基酸,推导分子量约29.69 kDa,此氨基酸序列与已知的Cyt2Ba1蛋白同源性最高,为92.4%。该基因被国际杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cyt2Ba16。杀虫活性分析表明:cyt2Ba16对双翅目的库蚊(Culex quinquefasciatus)具有显著的杀虫活性,LC50为9.73μg/mL。[结论]cyt2Ba16基因是一个对库蚊具有较高杀虫活性的新型cyt基因,为QL32-1菌株的应用提供理论基础。
EGCG通过STAT3抑制血管内皮细胞炎性因子表达 下载：84 浏览：519
摘要:
研究茶多酚EGCG对脂多糖(LPS)诱导的血管内皮细胞炎性因子表达的抑制作用及其机制。[方法]利用MTT和流式检测LPS和EGCG对血管内皮细胞的毒性作用,实时荧光定量PCR检测炎性因子mRNA的水平,多重液相蛋白定量技术检测炎性因子的蛋白表达,Western Blot检测STAT3及其磷酸化水平。[结果]EGCG最大浓度(100μmol/L)对血管内皮细胞无毒性;LPS处理可显著或极显著诱导炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8)在mRNA和蛋白水平的表达(P<0.05或P<0.01),LPS对炎性因子的促进作用具有剂量效应;25μmol/L或50μmol/L EGCG预处理能极显著抑制LPS诱导的血管内皮细胞炎性因子的表达(P<0.01),同时抑制LPS诱导的STAT3磷酸化;STAT3抑制剂能显著增强EGCG抗炎效果。[结论]EGCG通过STAT3通路抑制LPS诱导的血管内皮细胞炎症因子的表达。
