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EV71抗原双元植物表达载体构建及生菜瞬时表达 下载：88 浏览：520
摘要:
构建EV71 P1和3CD基因的双元植物表达载体,通过农杆菌注射渗透法实现在生菜叶片中的瞬时共表达。[方法]根据Gen Bank序列,设计合成EV71 C4亚型P1和3CD基因,分步克隆入植物表达载体p CAMBIA2301,并转化农杆菌LBA4404。农杆菌注射渗透法对意大利生菜叶片进行遗传转化,固相酶联斑点实验和免疫印迹实验检测感染叶片总蛋白提取物,分析外源基因表达效果。[结果]限制酶切验证获得共表达植物表达载体p CAMBIA2301-P1-3CD。感染叶片的外源基因表达产物中具有抗VP1抗体结合活性的蛋白,其分子量约39 k Da。[结论]成功构建EV71 3CD和P1基因双元植物表达载体,其在意大利生菜叶片中的表达产物具有免疫反应性。为利用植物生物反应器生产抗EV71口服疫苗提供了理论和实验依据。
美洲大蠊抗菌肽AMPPA13的表达及纯化 下载：86 浏览：523
摘要:
预测美洲大蠊新的抗菌肽基因,构建原核表达体系并纯化表达产物。[方法]通过生物信息学方法,预测分析出潜在的美洲大蠊抗菌肽。构建pET32a重组质粒,优化诱导表达条件,通过亲和层析,分子筛等手段获得纯化的抗菌肽,并进行Western Blot鉴定。[结果]预测出美洲大蠊新的抗菌肽基因AMPPA13,成功构建重组质粒pET32aAMPPA13。优化诱导表达条件得最佳IPTG浓度为0.1 mmol/L,最佳诱导时间为4 h,最佳诱导温度为37℃。纯化后AMPPA13浓度为268μg/m L。[结论]克隆出美洲大蠊抗菌肽基因,并成功构建原核表达体系,得到1 m L纯化的AMPPA13,经Western Blot鉴定,表达产物正确。
VISTA-Ig融合蛋白的表达及其包涵体复性研究 下载：86 浏览：521
摘要:
构建VISTA-Ig融合蛋白表达载体,进行诱导表达获得VISTA-Ig融合蛋白。[方法]以C57BL/6小鼠脾脏细胞c DNA为模板,扩增小鼠VISTA胞外段基因,利用重叠延伸PCR的方法合成VISTA-Ig融合基因,构建重组质粒p ET-22b-VISTA-Ig,在大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)中诱导表达。[结果]VISTA-Ig融合蛋白主要以包涵体的形式存在。变性后,利用镍柱纯化,通过采用氧化型/还原型谷胱甘肽(GSH/GSSG)复性体系,复性效率达到80%以上,提高了复性效率。利用r Protein A柱对目标蛋白进一步纯化,Western Blot鉴定结果显示,能与Ig G Fc(HRP)抗体特异性结合。[结论]成功构建了重组质粒p ET-22b-VISTA-Ig,纯化的VISTA-Ig包涵体蛋白复性效率得到明显提高,为后续VISTA-Ig免疫学功能的研究奠定了基础。
线粒体转录终止因子2对人子宫颈癌HeLa细胞线粒体基因表达的影响 下载：86 浏览：542
摘要:
线粒体转录终止因子2(mitochondrial transcription termination factor 2,MTERF2)是通过比较血清饥饿与血清培养的人成纤维细胞基因表达谱差异发现的一个细胞增殖抑制基因。该研究旨在从复制、转录和翻译水平探讨线粒体转录终止因子2对人子宫颈癌He La细胞线粒体基因表达的影响。[方法]利用MTERF2过表达质粒和shRNA干扰表达质粒分别瞬时转染人子宫颈癌He La细胞,通过qRT-PCR检测目的基因MTERF2表达水平的变化。采用荧光定量PCR检测MTERF2对线粒体DNA拷贝量的影响,半定量RT-PCR检测MTERF2对线粒体基因转录水平的影响,Western Blot检测MTERF2线粒体DNA重链编码ND1、CO1蛋白和轻链编码ND6蛋白表达水平的影响。[结果]转染人子宫颈癌He La细胞48 h后,通过荧光定量PCR检测线粒体DNA拷贝量发现,过表达MTERF2基因对线粒体DNA的拷贝量具有显著抑制作用(P<0.05),而敲低MTERF2基因对线粒体DNA拷贝量的影响无显著差异(P>0.05);半定量RT-PCR和Western Blot检测发现,MTERF2基因的过表达会显著降低线粒体编码基因的mRNA水平和线粒体编码蛋白水平(P<0.05),而敲低MTERF2后线粒体转录和翻译水平略有下降,但无显著差异(P>0.05)。[结论]在人子宫颈癌He La细胞中过表达MTERF2显著抑制线粒体DNA的复制水平,并且显著下调线粒体编码基因的转录和翻译水平,而敲低MTERF2后线粒体基因的表达无显著变化。
沙眼衣原体LpxA基因克隆及生物信息学分析 下载：86 浏览：517
摘要:
克隆沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)LpxA基因并分析其生物学特性。[方法]根据Ct LpxA基因序列设计特异性引物,利用PCR扩增LpxA基因,并把LpxA基因连接到p MD18-T载体,挑取阳性克隆进行PCR和DNA测序验证。最后使用生物信息学软件分析LpxA蛋白的生物学性质。[结果]从Ct基因组中PCR扩增得到840 bp的Ct LpxA基因,该基因共编码280个氨基酸。LpxA蛋白无信号肽,定位在细菌细胞质。二级结构预测得知α-螺旋占19.6%,延伸链占32.8%,β-转角为11.4%,无规卷曲为36%。三级结构预测得知3个相同的LpxA分子组成同源三聚体。预测得知LpxA蛋白有11个B细胞表位。[结论]克隆得到Ct LpxA基因,并预测了其结构和功能。
