对鞘糖脂内切糖苷酶EGCaseⅡ进行半理性设计,获得高水解活性突变体。[方法]用半理性设计方法进行突变库设计,利用HPLC对突变库进行筛选,随后对阳性突变体进行动力学及底物谱表征,并利用结构建模对活性提高的分子机制进行解析。[结果]获得了对鞘糖脂GM1、GM3水解活性提高的突变体S63G/D311E、I276L/D311V,活性分别提高为野生型的25.3倍、11.8倍。酶动力学表征显示,S63G/D311E的KM由0.17 mmol/L降低到0.06 mmol/L,kcat由5.5 min-1增大到50.3 min-1。酶-底物复合物模式结构分析表明,D311E、D311V、I276L这几种突变更有利于酶与底物结合,从而提高酶活性。[结论]通过半理性设计成功获得对GM1和GM3水解活性分别提高25.3倍和11.8倍的EGCaseⅡ突变体。

考察重组人Ig E Fc的抗过敏反应作用。[方法]建立阴离子交换和疏水层析为主的分离纯化工艺,从CHO细胞培养的上清中获得重组人Ig E Fc样品;利用流式细胞法测定重组人Ig E Fc与表达人FcεRIα的CHO3D10细胞的亲和力;利用表达人FcεRIαEG-RBL2H3的细胞评价重组人Ig E Fc对细胞活化的抑制;在猴体上考察重组人Ig E Fc阻止被动皮肤过敏反应的作用。[结果]制备的重组人Ig E Fc的纯度达到98%;重组人Ig E Fc与CHO3D10细胞的亲和常数为1.40×109(mmol/L)-1是人Ig E的5倍;重组人Ig E Fc的剂量为NP-Ig E的5或6倍时可完全抑制体外细胞活化和体内过敏反应。[结论]重组人Ig E Fc可以抑制Ig E介导的过敏反应,具有新型抗过敏药物开发的前景。

拟实现疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶TLL在毕赤酵母菌中的高效表达;初步探索该脂肪酶催化生物柴油的可行性及催化条件,为大规模工业生产生物柴油提供一种可行方案。[方法]比较分析α-信号肽和脂肪酶tll基因自身的信号肽对其分泌表达量的影响;构建脂肪酶tll基因多拷贝表达框,提高该基因在宿主基因组中的剂量,从而实现高效表达;直接以液体脂肪酶TLL为催化剂,采用单因子方法初步探索了其制备生物柴油的条件。[结果]α-信号肽融合和多拷贝均能提升TLL脂肪酶的表达水平。在14 L发酵罐中培养144 h后,发酵上清液的酶活可达到769 U/m L;液体脂肪酶TLL可成功地催化制备生物柴油,且获得88.3%的转酯率。[结论]该研究显著地提高了脂肪酶TLL的表达水平,初步确定了液体脂肪酶TLL可以直接制备生物柴油。

近年来,阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)在不同行业应用研究广泛,该文综述了阿氏芽孢杆菌发现和分布、研究方向、功能应用,展望了阿氏芽孢杆菌研究前景。

探讨土著细菌菌群(柠檬酸杆菌属51.58%、不动杆菌属25.49%、黄金杆菌属12.82%、肠杆菌属8.5%)对铀的去除效果及机理。[方法]考察温度、p H、U(Ⅵ)初始浓度对细菌菌群除铀影响,通过死活细菌菌群对比试验分析吸附还原所占比例,并通过SEM-EDS、FTIR和XRD分析除U(Ⅵ)机理。[结果]在p H为7.0、30℃、U(Ⅵ)初始浓度为9.6 mg/L时细菌菌群对铀的去除效果最好,去除率均达到96%以上;死活细菌对比试验发现细菌菌群对铀不仅有吸附作用还有还原作用。SEM-EDS显示除铀后细胞周围出现大量片状物质,新出现的U峰占细胞重量比的28.10%。FTIR结果显示细菌菌群细胞中氨基、羟基、羧基、酰胺和磷酸根基团在除铀过程中占主要作用。XRD显示说明细菌菌群对铀具有一定的矿化作用。[结论]从铀尾矿中选育出的细菌菌群具有协同作用,对铀具有较好的去除效果,其去除机理主要为以吸附和还原为主矿化作用为辅的生物沉淀作用。

探究微生物对农药乙酰甲胺磷的生物降解作用。[方法]利用筛选培养基从土壤中分离乙酰甲胺磷降解性菌株,对其中一株降解性能较好的菌株YJ1进行分析,扩增菌株16S r DNA,测序并构建系统演化树,结合生理生化性质,初步确定其分类地位,并检测该菌株对乙酰甲胺磷的降解性能。[结果]乙酰甲胺磷降解菌株YJ1属于芽孢杆菌属,可以在乙酰甲胺磷为唯一碳源的环境中存活;该菌株在乙酰甲胺磷含量为1 200 mg/L的培养基中生长良好;在p H7～10碱性条件下,该菌株在乙酰甲胺磷液体培养基中生长较好,酸性条件不利于其生长;该菌株在72 h对乙酰甲胺磷降解率可达100%,具有很高的乙酰甲胺磷降解活性。[结论]所发现的芽孢杆菌YJ1可用于乙酰甲胺磷的生物降解。

探讨siRNA介导的PKM2基因沉默对乳腺癌细胞中有氧糖酵解、细胞增殖和凋亡产生的影响。[方法]荧光定量PCR检测乳腺癌细胞转染siRNA-PKM2的效率,葡萄糖和乳酸试剂盒及Western Blot检测细胞的糖酵解能力,CCK-8法检测细胞增殖能力,Western Blot检测细胞的凋亡状况。[结果]与对照组相比,转染PKM2的siRNA 48h后,细胞摄取葡萄糖量及乳酸分泌量均明显降低(P<0.05),两种与糖酵解相关的蛋白Glut1和PFK-1表达量均降低;细胞增殖速率减慢(P<0.05);抗凋亡蛋白bcl-x L蛋白表达降低,促凋亡蛋白caspase-9蛋白表达增多。[结论]siRNA介导的PKM2基因沉默能抑制乳腺癌细胞的有氧糖酵解及增殖能力,并促进细胞凋亡。

构建CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)真核表达质粒并观察其蛋白表达。[方法]将NotⅠ的酶切位点(GCGGCCGCC)引入第一次PCR的后引物,扩增并突变h PROKR2的1-1035 bp(343YFK/AAA345),再将NotⅠ的酶切位点和3个连续甘氨酸突变碱基GCCGCCGCA引入第二次PCR的前引物扩增并突变h PROKR2的1036-1152bp(351HWR/AAA353),通过NotⅠ酶切位点连接前后两个片段,即可构建pc DNA3.1-h PROKR2-myc-his(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353),最后通过测序鉴定突变是否成功。扩增h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353),连接入CMV-3flag。Western Blot检测相应蛋白的表达。[结果]成功构建CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)质粒,并验证到相应蛋白表达。[结论]利用NotⅠ酶的碱基序列特性(GCGGCCGCC)进行3个连续氨基酸突变的方法简单有效。质粒CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)的成功构建为后期进一步实验创造条件。

构建融合CD3ζ的TCRαζβζ分子的双表达载体,并观察TCRαζβζ分子中的CD3ζ与细胞膜的共定位情况。[方法]设计重叠PCR引物,利用重叠PCR扩增携带荧光蛋白的融合基因TCRβζ-EYFP和TCRαζ,将其克隆到p IRES2-EGFP载体,构建双表达载体p IRES2-TCRβζ-EYFP/TCRαζ,将重组载体分别转染BEL-7402细胞和Jurkat T细胞,转染48 h后,细胞膜经Di D染料染色,共聚焦显微镜扫描并分析该TCRαζβζ分子的表达以及与细胞膜的共定位情况。[结果]重组双表达载体p IRES-TCRβζ-EYFP/TCRαζ经菌落PCR、酶切鉴定及测序分析证明载体构建成功;共聚焦显微镜扫描结果显示重组载体表达了融合蛋白TCRαζβζ分子;共定位程序分析显示TCRαζβζ分子中的CD3ζ与细胞膜存在共定位关系。[结论]成功构建了融合蛋白TCRαζβζ分子的双表达载体,TCRαζβζ分子中的CD3ζ与细胞膜存在共定位。

筛选与莱茵衣藻FOX1基因启动子结合的调控基因序列。[方法]利用酵母单杂交的方法,构建pHIS2.1-FOX1诱饵载体,并将其转入到酵母菌株Y187中,在SD/-Trp/-His/-Leu/50 mmol/L 3-AT筛选培养基上挑选酵母阳性转化子,PCR克隆阳性转化子的序列并测序,利用Blastx程序检索phytozome莱茵衣藻基因组数据库,获得阳性转化子序列的同源基因信息。[结果]18个酵母阳性转化子测序成功,其同源基因主要有CTR型铜离子转运体(CTR2)、核糖体蛋白,和参与光合作用、氧化还原反应和物质运输等方面的功能蛋白。[结论]利用酵母单杂交技术筛选到缺铁应答基因FOX1潜在的上游调控基因。

获得苏云金芽胞杆菌QL32-1中杀虫晶体蛋白基因,并分析其杀虫活性。[方法]采用cyt基因通用引物、两步法染色体步移的方法对QL32-1中cyt基因进行鉴定和全长克隆,再构建重组质粒pET-28a-2Ba16,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,最后对表达蛋白进行杀虫活性分析。[结果]克隆得到1个全长783 bp cyt2B基因,其编码260个氨基酸,推导分子量约29.69 kDa,此氨基酸序列与已知的Cyt2Ba1蛋白同源性最高,为92.4%。该基因被国际杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cyt2Ba16。杀虫活性分析表明:cyt2Ba16对双翅目的库蚊(Culex quinquefasciatus)具有显著的杀虫活性,LC50为9.73μg/mL。[结论]cyt2Ba16基因是一个对库蚊具有较高杀虫活性的新型cyt基因,为QL32-1菌株的应用提供理论基础。

研究茶多酚EGCG对脂多糖(LPS)诱导的血管内皮细胞炎性因子表达的抑制作用及其机制。[方法]利用MTT和流式检测LPS和EGCG对血管内皮细胞的毒性作用,实时荧光定量PCR检测炎性因子mRNA的水平,多重液相蛋白定量技术检测炎性因子的蛋白表达,Western Blot检测STAT3及其磷酸化水平。[结果]EGCG最大浓度(100μmol/L)对血管内皮细胞无毒性;LPS处理可显著或极显著诱导炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8)在mRNA和蛋白水平的表达(P<0.05或P<0.01),LPS对炎性因子的促进作用具有剂量效应;25μmol/L或50μmol/L EGCG预处理能极显著抑制LPS诱导的血管内皮细胞炎性因子的表达(P<0.01),同时抑制LPS诱导的STAT3磷酸化;STAT3抑制剂能显著增强EGCG抗炎效果。[结论]EGCG通过STAT3通路抑制LPS诱导的血管内皮细胞炎症因子的表达。

从线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subumitⅠ,COI)基因水平探讨盘羊对家绵羊有无遗传贡献,了解盘羊和塔什库尔干羊遗传多样性和系统进化。[方法]采用粪便DNA提取法、PCR和测序方法对3只盘羊和68只塔什库尔干羊共71个样品的线粒体COI基因全序列进行分析。[结果]塔什库尔干羊单倍型多样度为0.890±0.001 1,核苷酸多样性为0.00421,表明塔什库尔干羊遗传多样性较为丰富;系统发育分析表明,塔什库尔干羊有4个母系起源,分别是A、B、C和E世系。[结论]欧洲摩弗伦羊对塔什库尔干羊世系B有遗传贡献,基于线粒体COI基因分析,尚未发现盘羊对塔什库尔干羊有遗传贡献的分子证据。

建立高效检测家禽Mx功能区SNP方法 ,改进PCR SSCP。[方法]以引进品种和地方品种为研究对象,筛选引物,优化程序,通过二次PCR改进SSCP方法对Mx基因GTPase效应区SNP进行检测。[结果]SSCP检测引物分型检测及SNP分析,检测结果与测序一致。来航鸡检测到阳性结果,且PA检测的多态位点均由编码区A/G替换引起,济宁百日鸡和来航鸡两个群体PIC为0.2515和0.2628,呈低度多态。[结论]χ2独立性检验位点基因频率和基因型频率呈Hardy-Weinberg平衡,不同品种间位点8（S631N）基因型分布差异极显著（P<0.01）。改进后的PCR SSCP高效经济简便,为高通量后期检测、新位点筛选奠定基础。

获得舌鳞状细胞癌组织与正常舌组织中差异表达的长链非编码RNA,并进行功能注释和参与的生理过程进行初步分析。[方法]利用GEO数据库中GES13601的原始芯片数据,采用affymatrix软件套件对芯片数据进行重新均一化和标准化,并筛选差异表达的长链非编码RNA,查找其参与的生理过程。[结果]舌鳞状细胞癌组织与正常舌组织差异表达的基因个数为5 613个。其中在癌组织中上调的为2 951个,下调的共2 662个。从中筛选到长链非编码RNA 38个,上调19个,下调19个。其中的某些参与涉及肌肉、淋巴生长和癌细胞发送等生理过程,但是大部分的功能未知,尚需进一步研究。[结论]筛选到舌鳞状细胞癌相关的38个长链非编码RNA,为寻找早期舌鳞状细胞癌标志物提供了新的参考。

探知罗布人mtDNA遗传结构与遗传多样性,构建人群mtDNA遗传数据库。[方法]运用二代测序技术对164位罗布人mtDNA全序列进行检测、分型。[结果]共检出315处突变位点包含298处多态性位点,其中A263G、A750G、A4769G、A8860G、A15326G位点突变率为100%,核苷酸多样性为0.0084,平均核苷酸配对差异数目为9.4695;划分出27个单倍型,高频单倍型有:B5b2c/31.71%、H6a1b2/18.90%、D4c2a/13.41%、H9a/9.76%,单倍型多样性为0.8360,个体识别力为0.8309;主成分和邻接系统树分析显示:罗布人与维吾尔族、蒙古族、中亚人群遗传关系近,特别与维吾尔族亲缘关系最近。[结论]现代罗布人mtDNA遗传结构具有亚欧混合现象,遗传多样性丰富;单倍型主要集中在B(39.03%)、H(29.88%)、D(15.85%);mtDNA遗传结构数据可为人群在遗传进化、族源鉴定、个体识别等方面提供依据。

了解中国树花内生真菌的多样性及其系统发育关系。[方法]通过常规组织分离法,采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)分离培养中国树花内生真菌,对内生真菌的菌落、菌丝和孢子进行观察并结合r DNA-ITS序列的PCR扩增测序,对获得的ITS序列通过Gen Bank数据库搜索同源序列并进行分析确定其分类地位并构建系统发育树。[结果]从中国树花中分离得到可培养内生真菌51株,分属4纲、5目、7科、12属,其中青霉属(Penicillium sp.)和曲霉属(Aspergillus sp.)总相对分离率分别为47%、18%,为中国树花内生真菌优势属。[结论]首次对中国树花进行内生真菌的分离,并确定其分类地位,对分离得到的51株内生真菌进行合并相同菌落形态和显微结构,共获得18株内生真菌,通过系统发育分析发现这18株聚为5大类。

实现烟曲霉果胶酶AFPG基因在毕赤酵母表达并获得高产菌株;阐述果胶酶AFPG的基因剂量效应;探究果胶的水解工艺。[方法]采用PCR技术从烟曲霉扩增AFPG基因并克隆到p AO815载体;用同尾酶构建多拷贝串联表达盒,经线性化的质粒电转到毕赤酵母构建重组工程菌;采用实时荧光定量PCR检测AFPG基因拷贝数;用薄层层析(TLC)技术对果胶的酶解产物进行分析。[结果]SDS PAGE分析表明AFPG基因表达了一个约40 kDa的蛋白;拷贝数为2、3、5的重组子摇瓶发酵,蛋白含量分别为0.24 mg/mL、0.28 mg/mL、0.35 mg/mL;14 L高密度发酵比活为8783 U/mg;该酶最适温度和pH为70℃和5.0;在底物浓度0.7%(W/V),酶量20 U,水解果胶30 min,转化率达到12%。[结论]果胶酶AFPG的表达存在基因剂量效应,5拷贝是2拷贝表达量的1.5倍,可通过构建多拷贝获得高产菌株。果胶酶解效果明显,水解工艺研究为果胶酶的应用奠定基础。

纯化T2毒素并探讨其抗肝癌活性。[方法]采用萃取法、柱层析法和高效液相色谱法从污染的玉米粒中分离T2毒素,采用MTT法、结晶紫染色法、荧光染色法考察其对两种肝癌细胞数量和形态的影响,划痕实验考察对细胞迁移的影响。[结果]纯化后,T2毒素纯度达到98%;当T2毒素浓度为8μg/mL时,对肝癌细胞的抑制率分别为(95±1.34)%(Hep G2)和(97±2.59)%(SMMC-7721),IC50分别为0.003 77μg/mL和0.003 25μg/mL,且有剂量依赖性。给药24 h后,与对照组相比,贴壁细胞减少,细胞体积缩小,肿瘤细胞迁移能力减弱。[结论]T2毒素能够成为一种潜在的抗肝癌药物。

研究新型的H2S供体,验证其细胞有效性并阐述其作用机制。[方法]利用基于体外192串联双孔板的H2S气体检测方法,从约20 000个化合物中筛选发现了H2S的新型供体。通过醋酸铅试纸法和荧光探针H2S成像法,分别确定了新型H2S供体的细胞有效性,并对其作用机制进行了初步解析。[结果]研究发现的新型H2S供体AZD1152,可以通过与Cys和Hcys反应释放H2S,HEK293T和HepG2细胞经100μmol/L AZD1152处理8h后,H2S产生量能分别提高2倍、1.5倍。[结论]AZD1152是一个结构新颖且细胞有效的H2S供体,能使细胞内源性H2S含量提高1.5倍以上,其磷酸基团对于促进H2S的释放极为重要,该分子可为内源性H2S的生理病理研究提供分子探针工具,还可为相关疾病的治疗提供药物先导物。