构建能够专一性合成光学纯(R,R)-2,3-丁二醇的大肠杆菌工程菌,并进行发酵条件优化。[方法]将来源于多粘芽孢杆菌的(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh,来源于阴沟肠杆菌的α-乙酰乳酸合成酶基因bud B和α-乙酰乳酸脱羧酶基因bud A与表达载体p Tr C99A连接,导入大肠杆菌中构建人工合成途径。筛选最适的培养基和发酵条件,提高(R,R)-2,3-丁二醇的产量、产率和得率。[结果]获得高效合成(R,R)-2,3-丁二醇的工程菌株GXASB,筛选到最适碳源及其浓度为120 g/L木薯淀粉,最适pH为6.5,最适接种量为10%,在发酵罐中进行同步糖化法发酵,(R,R)-2,3-丁二醇产量达到105.28 g/L,光学纯为99.1%,得率为0.47 g/g,生产强度为1.95 g/(L·h)。[结论]在大肠杆菌中表达基因簇bud B-bud A-bdh能够专一性合成光学纯(R,R)-2,3-丁二醇,经优化发酵条件后,能够显著提高(R,R)-2,3-丁二醇的合成效率。同时工程菌能够利用非粮原料木薯淀粉高效生产(R,R)-2,3-丁二醇,补料发酵产量达到105.28 g/L,为使用廉价原料工业化生产(R,R)-2,3-丁二醇提供参考。

实现藻红蛋白在大肠杆菌中的高效生物合成。[方法]将藻红蛋白生物合成的多个基因构建到单一表达质粒上,质粒转化大肠杆菌后获得表达菌株,优化诱导物、诱导温度和诱导时长等发酵条件,利用亲和层析法分离纯化重组藻红蛋白,分析重组蛋白的光谱学性质与抗氧化活性。[结果]获得了高效生物合成藻红蛋白的大肠杆菌菌株,以乳糖为诱导物时最佳诱导条件为:2.0 g/L的乳糖、25℃下诱导28 h,藻红蛋白表达量达211.6 mg/L;以IPTG为诱导物时最佳诱导条件为:0.4 mmol/L的IPTG,在25℃条件下诱导28 h,藻红蛋白表达量达188.7 mg/L。藻红蛋白色基结合率达92.0%,OD555/OD280为8.0。[结论]成功实现了藻红蛋白在大肠杆菌中的高效生物合成,重组藻红蛋白具有羟基自由基的清除活性。

研究GAS7、JHDM1A基因在组织中的表达分布情况。[方法]试验采用荧光定量PCR技术,测定了苏香杂交猪的心、肝、脾、胃、肾、脑、小肠和背最长肌在各组织的分布表达情况。[结果]GAS7基因在脑表达含量最高(5.23±2.14),在心脏中表达量最低(0.07±0.03),且与脑中的表达量呈极显著差异(P<0.01),JHDM1A基因在脑部表达含量最高(32.79±12.76),在心脏(0.18±0.08)和肝脏(0.18±0.09)中表达量最低,且与脑中的表达量呈极显著差异(P<0.01)。[结论]GAS7基因主要在脑、肝脏组织表达并发挥其生理作用,而JHDM1A基因主要在脑组织表达并发挥其生理作用,此研究结果为进一步分析GAS7基因、JHDM1A基因在肉质或生长性能方面具体的分子作用机理奠定基础。

构建绒毛白蜡FvNCED3基因的植物过表达载体并对其基因功能进行分析。[方法]采用双酶切法将绒毛白蜡FvNCED3基因插入pROKⅡ载体中,构建pROKⅡ-FvNCED3植物表达载体;浸花法转化拟南芥,抗性种子经Kan筛选后进行PCR检测;测定不同盐浓度培养基中转基因幼苗和对照植株的鲜重与根长,鉴定其基因功能。[结果]双酶切重组质粒得到1 823 bp的目的片段,表明成功构建pROKⅡ-FvNCED3植物表达载体;转基因种子经50mg/L Kan筛选培养6 d时效果最好,转化率达4.97‰。耐盐性分析表明,盐胁迫下,转基因株系根长显著长于对照,且盐浓度为100 mmol/L、150 mmol/L时,其鲜重分别为对照的1.43倍、2.06倍。[结论]成功构建pROKⅡ-FvNCED3植物表达载体,经PCR证明FvNCED3基因整合到植物基因组中。转基因后代的耐盐性分析初步表明FvNCED3基因具有增强植物耐盐性的功能。

构建FBXO47基因3'-UTR双荧光素酶报告载体,并验证miR-33b-5p与FBXO47的靶向关系。[方法]采用生物信息学软件预测miR-33b-5p与FBXO47结合位点;利用PCR扩增FBXO47基因3'-UTR序列,将其克隆到GV272载体中,构建FBXO47野生型及突变型双荧光素酶报告质粒;将miR-33b-5p或阴性对照分别与野生型GV272-FBXO47-wt 3'-UTR或突变型GV272-FBXO47-mut 3'-UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。[结果]酶切及测序结果表明,野生型GV272-FBXO47-wt 3'-UTR及突变型GV272-FBXO47-mut 3'-UTR双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性结果表明,相较于对照组,miR-33b-5p可使野生型GV272-FBXO47-wt 3'-UTR的荧光素酶活性降低66%左右;而定点突变GV272-FBXO47-mut 3'-UTR的荧光素酶荧光素酶活性没有显著变化。[结论]成功构建了FBXO47基因3'-UTR的荧光素酶报告基因载体,miR-33b-5p与FBXO47存在靶向性。

植物生长发育过程钾具有很多重要的作用,植物吸收钾离子的重要途径中包含钾离子通道。近年来,已从同种植物的不同组织器官和多种植物中分离到多种钾离子通道基因,本文将从钾离子通道AKT1的结构、功能、调控机制以及其应用等四方面综述关于植物钾离子通道AKT1的研究进展,并对应用生物工程手段改良植物钾营养进行讨论。

对从江香猪λ1干扰素(interferon-λ1,IFN-λ1)基因进行扩增、克隆和生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank登录的猪IFN-λ1基因序列(FJ455508)设计合成特异性引物,通过RT-PCR从淋巴细胞中扩增IFN-λ1基因CDS区并进行克隆和生物信息分析。[结果]从江香猪IFN-λ1基因CDS全长576 bp,共编码191个氨基酸,其分子式为C949H1543N277O270S7,相对分子质量21.38 k Da;该蛋白等电点为9.42,为亲水性蛋白。从江香猪IFN-λ1含有丰富的二级结构,以α-螺旋(64.40%)和无规卷曲(25.65%)为主,蛋白质三级结构中主要以α-螺旋为主,同源性及系统进化树分析结果表明从江香猪与野猪IFN-λ1核苷酸同源性最高(为100%),亲缘关系最近。[结论]从江香猪IFN-λ1基因的克隆和生物信息学分析为进一步研究其抗病毒功能奠定了基础。

预测美洲大蠊新的抗菌肽基因,构建原核表达体系并纯化表达产物。[方法]通过生物信息学方法,预测分析出潜在的美洲大蠊抗菌肽。构建pET32a重组质粒,优化诱导表达条件,通过亲和层析,分子筛等手段获得纯化的抗菌肽,并进行Western Blot鉴定。[结果]预测出美洲大蠊新的抗菌肽基因AMPPA13,成功构建重组质粒pET32aAMPPA13。优化诱导表达条件得最佳IPTG浓度为0.1 mmol/L,最佳诱导时间为4 h,最佳诱导温度为37℃。纯化后AMPPA13浓度为268μg/m L。[结论]克隆出美洲大蠊抗菌肽基因,并成功构建原核表达体系,得到1 m L纯化的AMPPA13,经Western Blot鉴定,表达产物正确。

构建EV71 P1和3CD基因的双元植物表达载体,通过农杆菌注射渗透法实现在生菜叶片中的瞬时共表达。[方法]根据Gen Bank序列,设计合成EV71 C4亚型P1和3CD基因,分步克隆入植物表达载体p CAMBIA2301,并转化农杆菌LBA4404。农杆菌注射渗透法对意大利生菜叶片进行遗传转化,固相酶联斑点实验和免疫印迹实验检测感染叶片总蛋白提取物,分析外源基因表达效果。[结果]限制酶切验证获得共表达植物表达载体p CAMBIA2301-P1-3CD。感染叶片的外源基因表达产物中具有抗VP1抗体结合活性的蛋白,其分子量约39 k Da。[结论]成功构建EV71 3CD和P1基因双元植物表达载体,其在意大利生菜叶片中的表达产物具有免疫反应性。为利用植物生物反应器生产抗EV71口服疫苗提供了理论和实验依据。

构建VISTA-Ig融合蛋白表达载体,进行诱导表达获得VISTA-Ig融合蛋白。[方法]以C57BL/6小鼠脾脏细胞c DNA为模板,扩增小鼠VISTA胞外段基因,利用重叠延伸PCR的方法合成VISTA-Ig融合基因,构建重组质粒p ET-22b-VISTA-Ig,在大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)中诱导表达。[结果]VISTA-Ig融合蛋白主要以包涵体的形式存在。变性后,利用镍柱纯化,通过采用氧化型/还原型谷胱甘肽(GSH/GSSG)复性体系,复性效率达到80%以上,提高了复性效率。利用r Protein A柱对目标蛋白进一步纯化,Western Blot鉴定结果显示,能与Ig G Fc(HRP)抗体特异性结合。[结论]成功构建了重组质粒p ET-22b-VISTA-Ig,纯化的VISTA-Ig包涵体蛋白复性效率得到明显提高,为后续VISTA-Ig免疫学功能的研究奠定了基础。

线粒体转录终止因子2(mitochondrial transcription termination factor 2,MTERF2)是通过比较血清饥饿与血清培养的人成纤维细胞基因表达谱差异发现的一个细胞增殖抑制基因。该研究旨在从复制、转录和翻译水平探讨线粒体转录终止因子2对人子宫颈癌He La细胞线粒体基因表达的影响。[方法]利用MTERF2过表达质粒和shRNA干扰表达质粒分别瞬时转染人子宫颈癌He La细胞,通过qRT-PCR检测目的基因MTERF2表达水平的变化。采用荧光定量PCR检测MTERF2对线粒体DNA拷贝量的影响,半定量RT-PCR检测MTERF2对线粒体基因转录水平的影响,Western Blot检测MTERF2线粒体DNA重链编码ND1、CO1蛋白和轻链编码ND6蛋白表达水平的影响。[结果]转染人子宫颈癌He La细胞48 h后,通过荧光定量PCR检测线粒体DNA拷贝量发现,过表达MTERF2基因对线粒体DNA的拷贝量具有显著抑制作用(P<0.05),而敲低MTERF2基因对线粒体DNA拷贝量的影响无显著差异(P>0.05);半定量RT-PCR和Western Blot检测发现,MTERF2基因的过表达会显著降低线粒体编码基因的mRNA水平和线粒体编码蛋白水平(P<0.05),而敲低MTERF2后线粒体转录和翻译水平略有下降,但无显著差异(P>0.05)。[结论]在人子宫颈癌He La细胞中过表达MTERF2显著抑制线粒体DNA的复制水平,并且显著下调线粒体编码基因的转录和翻译水平,而敲低MTERF2后线粒体基因的表达无显著变化。

克隆沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)LpxA基因并分析其生物学特性。[方法]根据Ct LpxA基因序列设计特异性引物,利用PCR扩增LpxA基因,并把LpxA基因连接到p MD18-T载体,挑取阳性克隆进行PCR和DNA测序验证。最后使用生物信息学软件分析LpxA蛋白的生物学性质。[结果]从Ct基因组中PCR扩增得到840 bp的Ct LpxA基因,该基因共编码280个氨基酸。LpxA蛋白无信号肽,定位在细菌细胞质。二级结构预测得知α-螺旋占19.6%,延伸链占32.8%,β-转角为11.4%,无规卷曲为36%。三级结构预测得知3个相同的LpxA分子组成同源三聚体。预测得知LpxA蛋白有11个B细胞表位。[结论]克隆得到Ct LpxA基因,并预测了其结构和功能。

研究维吾尔族群体线粒体DNA高变区Ⅰ序列遗传多态性。[方法]收集240份新疆8个地域维吾尔族无关个体mt DNA高变区Ⅰ进行测序分析。[结果]发现多态性位点数为:喀什、和田、库车、且木、伊犁、哈密、吐鲁番、尉犁维吾尔族分别为75、98、59、111、75、46和94。单倍型多样性分别为:喀什群体为0.996±0.014,和田群体为0.993±0.014,库车群体为0.993±0.015,且木群体为0.993±0.014,伊犁群体为0.993±0.013,哈密群体为0.995±0.012,吐鲁番群体为0.993±0.012,尉犁群体为0.994±0.023。用HVRⅠ序列多态性数据计算Fst和d A两种遗传距离,相关系数为r=0.993(P<0.01)。[结论]中国的维吾尔族人群mt DNA其遗传多态性和个体识别力比较高,并且维吾尔族群体是东亚与欧洲人群的过渡人群,这些数据可用于法医学、人类学、遗传制图个体识别等领域研究。

研究新型MEK抑制剂BI-847325对BRAFV600E突变型甲状腺癌细胞BCPAP增殖的抑制作用以及对凋亡相关蛋白、摄碘蛋白钠/碘转运体(sodium/iodide symporter,NIS)的表达调控。[方法]不同浓度的BI-847325处理BCPAP细胞,CCK-8法测定存活率并计算半抑制浓度IC50;流式细胞术测定细胞凋亡;Western Blot测定MEK 1/2、ERK1/2的活化水平及其下游抗凋亡蛋白BCL-2、促凋亡蛋白BIM、BAX,以及NIS的表达。[结果]BI-847325浓度依赖性抑制BCPAP细胞的增殖,48 h IC50为0.46μmol/L。BI-847325浓度为0.4μmol/L时,BCPAP细胞凋亡率为(26.41±2.23)%,差异极显著(p<0.01);BI-847325可以抑制MEK 1/2、ERK1/2的活化,下调BCL-2、上调BIM和BAX的表达,并上调NIS的表达。[结论]BI-847325通过MEK信号通路诱导甲状腺癌细胞BCPAP细胞凋亡,并上调NIS的表达,有促进131I摄取的潜力。

筛选调控BLM基因表达的miRNAs并研究其抑制效率。[方法]利用Target Scan Human 6.2、microRNA.org、PicTar以及miRsystem在线软件预测调控BLM基因表达的miRNAs;miRNA通过脂质体转染和特异茎环引物反转录、荧光定量PCR及Pfaffl算法检测miRNA对BLM基因表达的影响。[结果]初步筛选出hsa-miR-338-3p为调控BLM基因表达的miRNA;hsa-miR-338-3p抑制效率试验结果表明:当前列腺癌细胞(PC3)转染20μmol/L的hsamiR-338-3p minic时,实验组BLM表达量为对照组的0.44倍,抑制了BLM的表达(P<0.01);转染40μmol/L的hsa-miR-338-3p minic时,实验组BLM的表达量为对照组的2.55倍,促进了BLM的表达(P<0.01);转染60μmol/L的hsa-miR-338-3p minic时,实验组BLM的表达量为对照组的1.14倍,实验组与对照组差异不显著(P>0.05)。[结论]转染20μmol/L、40μmol/L和60μmol/L的hsa-miR-338-3p minic时BLM基因的表达量分别是对照组的0.44倍、2.55倍和1.44倍,转染不同剂量的miRNA对BLM基因的表达情况具有不同的影响。

探讨BKca通道蛋白对B族Ⅰ型清道夫受体(SR-B1)表达和调控胆固醇转运的影响。[方法]人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外传代培养2～5代,分为对照组、过表达BKca组和基因干扰BKca组。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法分别检测BKca的α及β亚基、SR-B1 mRNA和蛋白表达水平及胆固醇检测试剂盒检测胆固醇流出水平。[结果]与对照组相比,BKca过表达后SR-B1 mRNA及蛋白表达水平明显升高和基因干扰BKca后SR-B1 mRNA及蛋白表达水平明显降低(均P<0.05)。BKca过表达后胆固醇流出水平明显升高,而基因干扰BKca后的胆固醇流出水平明显下降(均P<0.05)。[结论]BKca通道蛋白上调SR-B1的表达,促进细胞内胆固醇的流出。

构建稳定表达荧光素酶基因的人肝癌细胞株,建立可实时观察的肝癌原位移植瘤模型。[方法]构建含有萤光素酶基因的慢病毒载体,利用慢病毒三质粒系统磷酸钙共转染HEK 293T细胞,收集纯化病毒感染肝癌细胞SMMC7721,嘌呤霉素(puromycin)结合有限稀释法筛选稳定转导细胞株,将细胞原位注射裸鼠肝组织,建立原位肝癌动物模型。[结果]包装纯化的慢病毒悬液的滴度为8.4×106TU/m L,感染肝癌细胞后成功筛选到稳定表达的肝癌细胞株。利用该细胞株成功建立原位注射肝癌裸鼠模型,经活体荧光成像系统观察到肝癌细胞在活体动物体内的分布情况。[结论]荧光素酶肝癌细胞株的成功构建及利用该细胞株建立的原位移植瘤肝癌动物模型为肝癌的治疗研究奠定了基础。

随着时代的进步与发展,现代化信息服务正逐渐走入人们的生活中,各行各业将大数据时代带来的先进技术运用到工作和生活中,为行业发展带来了全新的理念。在运动训练科学中运用大数据理论,是体育运动的发展趋势,也是一种全新的思维方式。本文从分析大数据时代运动训练科学研究的现状出发,结合传统数据时代运动科学研究出现的问题,对运动训练科学研究的新路径提出几点建议。

筛选拟微绿球藻耐高温突变株,提高其高温耐受能力,延长夏季养殖时间。[方法]对拟微绿球藻进行3次EMS重复诱变和反复45℃高温处理后,利用200 mmol/L HYP压力进行48孔板和24孔板两轮筛选,得到的优势突变株进行反应器高温培养评价和夏季室外培养验证。[结果]夏季室外培养,突变株HT39最终生物积累量和EPA含量分别达到1.93 g/L和3.62%,比野生株提高48.0%和21.9%。[结论]利用重复诱变和多孔板压力筛选的方法获得的优势突变株HT39夏季室外培养表现出较强的高温耐受性能,为选育重要经济藻株拟微绿球藻耐高温品系提供了方法依据。

提高工业酿酒酵母Sc4126对木质纤维素预处理过程中产生的发酵抑制物的耐受性。[方法]采用紫外诱变结合驯化对工业酿酒酵母Sc4126进行选育,对筛选出的三株菌株Sc4126-1、Sc4126-2、Sc4126-3在复合抑制剂和单一抑制剂存在下对比考查其发酵性能。[结果]相比原始菌株,3株菌株对抑制剂的耐受性均不同程度地提高。在复合抑制剂存在下,优势菌株Sc4126-1发酵时间为48 h,乙醇平均产率0.19 g/L·h,而原始菌株Sc4126发酵时间138 h,乙醇平均产率0.06 g/L·h,相比原始菌株,优势菌株发酵时间缩短65.22%,乙醇平均产率提高2.17倍。对于单一抑制剂,改造后的菌株对糠醛、香草醛的耐受性明显提高,而对乙酸的耐受性提高较少。[结论]通过紫外诱变结合驯化的方法,有效提高了工业酿酒酵母Sc4126对抑制剂的耐受性。