文章-世纪中文出版社

李梓彤1,2 卢洁1,2 顾宗润1,2 杨帅1,2 衣珊漪3 任灵玲1,2 刘灵芝1,2 《中国土壤》 2019年2期

摘要:

氨氧化细菌是参与土壤氮素循环的重要微生物类群之一,其基因组DNA提取质量的准确分析,可直接影响后续分子实验的可行性和精确性。本试验针对3株异养氨氧化细菌的纯培养菌株,应用琼脂糖凝胶电泳、微量紫外分光光度计和Qubit荧光计分别检测不同提取方法获得的基因组DNA的浓度,同时结合细菌通用引物扩增16S r DNA全长来判定提取DNA的质量,进而筛选出可用于检测可培养氨氧化细菌基因组DNA浓度的方法。研究结果表明,针对不同浓度的DNA样品,尽管3种检测方法获得的结果表现出明显差异,但在16S r DNA-PCR中均仍能获得良好的扩增结果。与微量紫外分光光度法相比,Qubit方法对基因组DNA浓度的检测结果更为精确,特别在低浓度DNA检测中,能够较真实的反映基因组DNA的实际情况。

稻-稻-油轮作土壤解磷菌与解钾菌的分离与鉴定下载：79 浏览：472

张立成1,2 杨敬林3 王璟3 黄蔚3 杨胜3 胡德勇3 《中国土壤》 2018年10期

摘要:

利用湖南省安仁县渡口乡的长期定位试验平台（建于1985年4月）,研究稻-稻-油菜轮作土壤中芽胞杆菌丰度变化以及对作物产生促生长作用的解磷菌和解钾菌的影响。试验于2015年7月、2015年10月和2016年4月从试验点采集土壤样品、测定芽胞杆菌丰度、分离解磷和解钾菌株并进行种属鉴定和能力测试。通过荧光定量PCR分析,发现稻-稻-油菜轮作土壤中芽胞杆菌的数量较稻-稻连作土壤高24%36%。通过Blast在线比对,发现轮作和连作土壤中解磷和解钾菌属类存在不同,但优势菌类均为芽胞杆菌。通过解磷和解钾量大小分析,发现分离自轮作土壤和连作土壤的菌株之间并无显著差异。结果表明,与稻-稻连作相比,稻-稻-油菜轮作能够提高土壤中芽胞杆菌的丰度,且影响解磷菌和解钾菌的种类。

胃癌组织中Notch1、Jagged1、Hes1的表达及临床意义下载：55 浏览：390

王春斐1 桂忠娜2 田强1 曲红梅1 宗蕾1 李登欣1 《肿瘤研究》 2018年5期

摘要:

[目的]探讨胃癌组织及其相应癌旁组织中Notch1及其配体Jagged1、下游信号Hes1的表达情况，并分析其临床意义。[方法 ]采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测胃癌组织及其相应的癌旁组织(距癌组织>5cm)中Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA的表达，免疫组织化学染色法检测Notch1、Jagged1、Hes1蛋白的表达，并分析三种蛋白的表达与胃癌临床病理特征的关系。[结果]免疫组织化学染色、qRT-PCR结果均显示Notch1、Jagged1在癌旁组织中的表达高于胃癌组织(P<0.05)，Hes1在癌旁组织中的表达低于胃癌组织(P<0.05)。Notch1、Jagged1、Hes1的表达与肿瘤脉管浸润、分化程度、浸润深度相关(P<0.05)，而与年龄、性别、TNM分期、淋巴结转移无关(P>0.05)。胃癌组织中Notch1与Jagged1的表达呈正相关(r=0.032，P<0.05)，而Jagged1与Hes1的表达呈负相关(r=-0.862，P<0.001)。[结论 ]Notch信号通路中Notch1受体及其配体Jagged1在胃癌组织中低表达，Hes1在胃癌组织中高表达，提示Notch1、Jagged1、Hes1的表达有望为胃癌诊断提供理论依据。还原

解淀粉芽孢杆菌TF28活菌定量PMA-qPCR技术下载：67 浏览：484

张淑梅1,2 姜威1,2 胡基华1 孟利强1,2 李晶1,2 夏海华1,2 《生物技术研究》 2020年11期

摘要:

建立解淀粉芽孢杆菌TF28特异性活菌分子定量技术。[方法]基于TF28特有基因设计q PCR引物,建立菌株特异性q PCR技术;优化PMA处理条件,建立PMA-q PCR定量TF28活菌技术,对其特异性、灵敏性与可靠性进行检测。[结果]建立的q PCR技术对菌株TF28具有特异性。优化的PMA处理条件为:PMA终浓度150μmol/L、暗培养10 min、光照20 min,在此条件下,可封闭106cfu/m L以下死菌基因组DNA;建立的PMA-q PCR技术特异性强,灵敏度高,最低检测限102cfu/m L;线性关系好,R2=0.997;在菌浓度103cfu/m L～107cfu/m L范围内重复性好,CT值变异系数小于2%,与平板活菌计数比较,差异不显著。[结论]建立的PMA-q PCR技术对TF28具有特异性,能够对菌浓度103cfu/m L～107cfu/m L活菌进行定量。

水中大肠菌群微滴数字PCR定量检测方法的建立下载：57 浏览：389

马薇1 孔义军1 吴伟健1 刘桂环2 《中国环境保护》 2019年2期

摘要:

以大肠菌群的lacZ基因为靶基因,建立一种快速、稳定、灵敏、特异的微滴数字聚合酶链式反应（Droplet Digital Polymerase Chain Reaction,ddPCR）定量检测方法。对ddPCR反应体系中试剂浓度、退火温度等条件优化筛选的同时,考察了方法的线性范围、精密度和定量限。最终确定反应体系中的最佳引物和探针浓度分别为0.2和0.5μmol/L,最佳退火温度为56℃。大肠菌群lacZ基因组DNA浓度范围为3.95～7.80×10～4拷贝（copies）/20μL ddPCR反应液时,方法的线性关系良好（R2=0.999）。文章所建立的方法可检出每微升单个拷贝数的大肠菌群lacZ基因组DNA,且具有快速测定、灵敏度高、特异性强、重复性良好等特点,为建立水污染早期应急机制提供了重要的参考价值。

数字PCR技术的发展及应用下载：29 浏览：323

李慧调潘建章方群《应用化学学报》 2020年9期

摘要:

数字PCR(Digital PCR， dPCR)是继实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR， qPCR)之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术，通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行PCR扩增，并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统PCR技术相比，数字PCR技术不依赖于标准曲线，具有更高灵敏度、准确度及高耐受性，可实现对样品的绝对定量分析。近年来，随着微流控技术日臻成熟，基于微流控技术的数字PCR技术得到了快速的发展，在基因突变检测、拷贝数变异检测、病毒微生物检测、转基因食品检测以及测序等方面均得到广泛的应用。本文对数字PCR的原理、技术发展和应用进行了概述。

一种快速高效的DNA提取方法及其在qPCR检测金黄色葡萄球菌中的应用下载：48 浏览：431

田小兰1 冯俊丽1,2 汪艺1 《中国食品与营养》 2019年8期

摘要:

探究一种高效快速便捷地提取菌体DNA的方法,并将其应用于金黄色葡萄球菌的定量检测。运用热裂解过柱法和直接热裂解法提取菌体DNA,同时用试剂盒法提取DNA作为对比。用qPCR检测技术对样本DNA的提取效果进行验证,并将最优的提取方法应用于纯培养的和人工污染的鱼样品中金黄色葡萄球菌的检测。qPCR检测结果显示热裂解过柱法仅比试剂盒法低一个梯度,体现了热裂解过柱法良好的稳定性、高效性和实用性。热裂解过柱法可高效提取样品中金黄色葡萄球菌的DNA,结合qPCR技术,其检测灵敏度可达1.04×10～2 cfu/m L。

数字PCR技术的发展及应用下载：29 浏览：305

李慧调潘建章方群《应用化学学报》 2020年7期

摘要:

数字PCR(Digital PCR， dPCR)是继实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR， qPCR)之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术，通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行PCR扩增，并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统PCR技术相比，数字PCR技术不依赖于标准曲线，具有更高灵敏度、准确度及高耐受性，可实现对样品的绝对定量分析。近年来，随着微流控技术日臻成熟，基于微流控技术的数字PCR技术得到了快速的发展，在基因突变检测、拷贝数变异检测、病毒微生物检测、转基因食品检测以及测序等方面均得到广泛的应用。本文对数字PCR的原理、技术发展和应用进行了概述。

一例猪伪狂犬病病原的鉴定下载：12 浏览：378

黄宇翔张军王志强邹跃陈亮吴宪候美如《当代畜牧兽医》 2020年9期

摘要:

试验从疑似猪伪狂犬病毒感染的仔猪脑、淋巴结、脾中分离到一株病毒,经vero细胞培养、PCR检测、动物试验结果,初步证明该分离株为猪伪狂犬病毒强毒株。该毒株的成功分离,为猪伪狂犬病的进一步研究奠定基础。

大帽藓科植物ISSR-PCR反应体系优化下载：82 浏览：492

沙毕热木·斯热义力1 张梅娟2 买买提明·苏来曼1 沙伟2 《生物技术研究》 2019年5期

摘要:

建立大帽藓科ISSR-PCR实验最佳反应体系。[方法]提取大帽藓科的基因组DNA,利用5因素4水平的正交设计实验方法对大帽藓科植物ISSR-PCR反应体系进行最佳反应体系的筛选。[结果]大帽藓科植物ISSRPCR的最佳反应体系为(20μL):即20μL体系中,PCR Buffer 2. 0μL、Mg2+2. 25 mmol/L,d NTP 0. 2 mmol/L,引物0.65μmol/L,Taq DNA聚合酶0. 7 U,模板DNA 10 ng。5个因素对该反应体系的影响顺序为:Mg2+>引物> d NTP> Taq DNA聚合酶>模板DNA。利用该体系,在UBC808等13种引物中进行验证,均能得到有效的扩增条带。[结论]通过对大帽藓科基因组DNA的提取及体系优化,获得了大帽藓科植物最佳反应体系,为后续应用ISSR技术鉴定大帽藓科种质资源以及遗传多样性研究奠定了基础。

小叶章PPDK基因的克隆和生物信息学分析下载：81 浏览：482

王丽媛张玉徐明怡伍一宁冷海楠许楠倪红伟《生物技术研究》 2019年5期

摘要:

获得小叶章PPDK的cDNA序列,推测蛋白氨基酸理化性质及二三级结构等,以及已知物种PPDK氨基酸系统进化分析。[方法]利用RT-PCR技术扩增PPDK序列,通过ProtParam、Blast、THMHMM、SOPMA等生物信息软件分析序列。[结果]获得了小叶章PPDK的c DNA序列,长1 035 bp,相对分子量41. 910 kDa,等电点为9. 70,氨基酸中含量最高的是丝氨酸,72个;蛋白二级结构中无规卷曲占48. 83%,不含信号肽和跨膜结构,氨基酸系统进化树结果分析发现小叶章PPDK与二穗短柄草、水稻亲缘关系最近。[结论]小叶章PPDK含有385个氨基酸,含1个PDRP活性调控位点,72个参与信号传导的磷酸化位点。

IL35慢病毒质粒的提取下载：82 浏览：488

李婷刘潺潺《生物技术研究》 2019年2期

摘要:

构建可以大规模提取IL35的新型质粒p LVX-IRES-Zs Green1-mus-IL35。[方法]质粒p LVX-IRES-Zs Green1和p UC57-mus-IL35-拼接用XhoⅠ和NotⅠ进行双酶切,将回收纯化的目的片段mus-IL35-拼接(NotⅠ/XhoⅠ)与回收纯化的载体p LVX-IRES-Zs Green1(NotⅠ/XhoⅠ)连接,连接产物命名为p LVX-IRES-Zs Green1-mus-IL35-拼接。连接产物转化DH5α感受态细胞,涂布LB Amp平板,37℃温箱培养过夜。[结果]检测慢病毒p LVX-IL35滴度为:6×10～7TU/ml,提取质粒浓度为1～2 mg/ml。鉴定引物为测序的通用引物,上游引物和下游引物离MCS区域加上目的序列,目的PCR条带大约1 600 bp,送鉴定正确菌液测序。测序结果比对正确。[结论]采用新型超量无内毒素质粒提试剂盒,可以大规模方便快速提取相关质粒。

发育期火龙果内参基因的筛选和验证下载：86 浏览：482

崇慧影文晓鹏《生物技术研究》 2019年2期

摘要:

筛选火龙果果实发育期稳定表达的内参基因。[方法]以火龙果不同发育时期的果实为材料,利用qRT-PCR技术检测17个看家基因的表达水平,借助ge Norm和Norm Finder筛选出果实发育期理想的内参基因。[结果]Ge Norm评估YLS8和ACT并列排名第一,表达稳定值均为0. 221,配对差异值V2/3为0. 105; Norm Finder排名前两名为TBP2和YLS8,表达稳定值为0. 160和0. 191。使用内参基因YLS8和TBP2分析火龙果甜菜色素合成途径关键基因HpCytP450-like1的表达水平,与基因Hp Cyt P450-like1在火龙果果实发育期表达趋势一致。[结论]从17个候选基因中筛选出2个理想的的内参基因YLS8和TBP2,可作为火龙果果实发育期相关基因的表达调控研究。

DNA模板中发卡结构对定量PCR扩增的影响下载：84 浏览：498

范慧君1 王静1,2 梁兴国1,2 《生物技术研究》 2018年9期

摘要:

探究模板引物结合区发卡对定量PCR的影响及优化方法。[方法]用分布连接法构建一系列在模板引物结合区含环大小为5～60 nt,茎长9 bp的DNA模板,考察发卡环部大小、茎干区GC含量对q PCR扩增效率的影响,再针对引物浓度、引物长度及退火温度来优化含发卡结构DNA模板的扩增。[结果]环区为5～40 nt时,其Ct值比对照组高1.3～4.2,对q PCR的抑制作用与环大小成负相关;茎长9 bp发卡结构当GC含量达3 bp以上时会对定量扩增产生明显抑制作用;增加引物长度、提高引物浓度和退火温度可提高发卡模板的扩增效率。[结论]模板引物结合区环大小在40 nt以内,茎长达9 bp的发卡结构对q PCR扩增会产生抑制作用,通过增加引物长度、提高引物浓度和退火温度可缓解此类抑制。

一种高效筛选MxGTPase效应区SNP方法下载：70 浏览：480

尹春光1 秦宏伟1 彭浩1 王晓强1 杜立新2 赵桂苹2 《生物技术研究》 2018年6期

摘要:

建立高效检测家禽Mx功能区SNP方法 ,改进PCR SSCP。[方法]以引进品种和地方品种为研究对象,筛选引物,优化程序,通过二次PCR改进SSCP方法对Mx基因GTPase效应区SNP进行检测。[结果]SSCP检测引物分型检测及SNP分析,检测结果与测序一致。来航鸡检测到阳性结果,且PA检测的多态位点均由编码区A/G替换引起,济宁百日鸡和来航鸡两个群体PIC为0.2515和0.2628,呈低度多态。[结论]χ2独立性检验位点基因频率和基因型频率呈Hardy-Weinberg平衡,不同品种间位点8（S631N）基因型分布差异极显著（P<0.01）。改进后的PCR SSCP高效经济简便,为高通量后期检测、新位点筛选奠定基础。

果胶酶基因剂量效应与水解果胶的工艺研究下载：84 浏览：512

彭小波杨江科陈光军《生物技术研究》 2018年5期

摘要:

实现烟曲霉果胶酶AFPG基因在毕赤酵母表达并获得高产菌株;阐述果胶酶AFPG的基因剂量效应;探究果胶的水解工艺。[方法]采用PCR技术从烟曲霉扩增AFPG基因并克隆到p AO815载体;用同尾酶构建多拷贝串联表达盒,经线性化的质粒电转到毕赤酵母构建重组工程菌;采用实时荧光定量PCR检测AFPG基因拷贝数;用薄层层析(TLC)技术对果胶的酶解产物进行分析。[结果]SDS PAGE分析表明AFPG基因表达了一个约40 kDa的蛋白;拷贝数为2、3、5的重组子摇瓶发酵,蛋白含量分别为0.24 mg/mL、0.28 mg/mL、0.35 mg/mL;14 L高密度发酵比活为8783 U/mg;该酶最适温度和pH为70℃和5.0;在底物浓度0.7%(W/V),酶量20 U,水解果胶30 min,转化率达到12%。[结论]果胶酶AFPG的表达存在基因剂量效应,5拷贝是2拷贝表达量的1.5倍,可通过构建多拷贝获得高产菌株。果胶酶解效果明显,水解工艺研究为果胶酶的应用奠定基础。

利用PCR技术鉴定河豚鱼的探索下载：94 浏览：497

江瑞宁万苾馨苏新华窦向梅《生物学报》 2019年1期

摘要:

利用聚合酶链反应(PCR)技术,建立鱼类制品中河豚鱼成分的分子生物学鉴定方法,弥补河豚鱼形态学鉴定的缺陷。方法:通过阅读文献,确定河豚鱼鉴定的靶基因并筛选特异性引物,提取河豚鱼DNA,优化PCR反应条件,扩增河豚鱼特异性DNA片段,并通过DNA电泳显示特异性扩增的DNA条带。结果:选择细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)作为河豚鱼成分鉴定的靶基因,PCR最佳反应条件是退火温度68℃,镁离子浓度2.0 mmol/L,DNA模板加入量0.07～0.1μg。河豚鱼特异性引物具有较好的特异性,与市场上常见的鲤鱼、草鱼等水产品无交叉反应。结论:所建立的PCR方法可以有效鉴定鱼类制品中河豚鱼成分。

KAP1在食管鳞癌中的表达及意义下载：61 浏览：417

刘博1 郭莉2 田剑2 刘军超1 李志军2 李凤玉2 《预防医学杂志》 2020年7期

摘要:

目的研究KRAB相关蛋白1(KAP1)在食管鳞癌(ESCC)中的表达及意义。方法选取手术切除的原发性ESCC136例、高级别上皮瘤变(HGIN)35例、低级别上皮瘤变(LGIN)29例和距肿瘤边缘5cm以上的正常食管黏膜组织(NEE)37例,采用免疫组化SP法对以上各组织中KAP1蛋白的表达情况进行检测,分析其与ESCC肿瘤发生发展及患者预后的相关性;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)对20例匹配的ESCC和NEE组织中KAP1基因的表达进行检测。结果①KAP1蛋白的表达从NEE (24.3%)、LGIN(31.0%)、HGIN(45.7%)及ESCC(55.9%)呈逐渐增高趋势,差异均具有统计学意义(P=0.002);②KAP1的异常表达与pTNM分期、浸润深度及淋巴结转移相关(P<0.05);③qRT-PCR结果显示,与配对的NEE组织相比,ESCC组织中KAP1的相对表达量明显升高(P<0.01);④136例ESCC患者的5年总体生存率为13.2%。ESCC患者的5年生存率与组织学分级、pTNM、浸润深度、淋巴结转移等具有相关性(P<0.05),KAP1的表达与ESCC患者的预后不相关。结论 KAP1的过表达在ESCC的发生、发展和转移中起重要作用,可作为理想的肿瘤标志物辅助ESCC诊断、指导临床治疗。

广州市58株单增李斯特菌菌株特征分析下载：43 浏览：371

张晶白志军和鹏陶霞吴新伟《预防医学杂志》 2019年12期

摘要:

目的了解广州市动物源性食品中单增李斯特菌菌株优势血清型、携带毒力基因和分子分型情况。方法对广州地区365份动物源性食品中的单增李斯特菌分离鉴定,并进行血清分型,毒力基因鉴定和肠道细菌基因间重复序列扩增(ERIC-PCR)。结果单增李斯特菌阳性率为15.89%(58/365),其中生畜肉类检出率最高,为25.38%(33/130);血清型分析将58株单增李斯特菌分为4种血清型,分别为1/2b、1/2a、1/2c和4b,优势的血清型为1/2b(44.80%)和1/2a(32.80%);10株缺失毒力基因actA;ERIC-PCR扩增出9～18条100～8 000 bp之间的条带,将58株单增李斯特菌在相似系数为0.8处分为6个群19个类型。结论广州市动物源性食品中单增李斯特菌菌株污染严重,优势血清型是与人或动物感染有关的致病血清型(1/2b和1/2a),大部分毒力基因均存在,ERIC-PCR结果显示分子型别呈多样性,应加强防控。

舒筋止痛水治疗肩周炎模型兔对血清中炎症因子IL-1β、TNF-α、COX-2的影响研究下载：61 浏览：443

康佳珺《现代康复医学》 2018年4期

摘要:

目的:观察舒筋止痛水对肩周炎兔血清中炎症因子IL-1β、TNF-α、COX-2的影响。方法:将12只新西兰兔随机分为空白组(清水治疗)、治疗组(舒筋止痛水治疗)各6只,持续机械劳损加冰敷造模3天后对两组模型兔行血清标本取材,造模成功后治疗组进行舒筋止痛水外用涂擦治疗,空白组则进行清水外用涂擦,14天后分别对两组模型兔进行血清标本取材,采用Tripure提取血清中的RNA,并用逆转录试剂盒对mRNA逆转录为cDNA用于荧光定量分析。结果:造模后,血清中各指标的相对表达量均有所上升,其中IL-1β和COX-2分别为未处理前的5.87倍和7.85倍,且二者与未处理相比差异有统计学意义,而TNF-α仅增加0.8倍,差异无统计学意义;治疗后空白组血清中炎症因子IL-1β、TNF-α、COX-2均未见明显改变,而治疗组血清中炎症因子IL-1β、TNF-α、COX-2均有下降,其中COX-2下调最显著,与舒筋止痛水治疗肩周炎兔疗效相符,为最佳指标。结论:舒筋止痛水外用治疗肩周炎模型兔,可通过抑制炎症因子IL-1β、COX-2表达进而减轻炎症,具有治疗肩周炎的作用。

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